本发明专利技术涉及一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，包括如下步骤：(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；(2)将种子液接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养，然后加入扩张蛋白溶液，继续培养，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；(3)从发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖。本发明专利技术将扩张蛋白应用于蛹虫草多糖的液体发酵生产，胞内多糖产量和胞外多糖产量分别比现有技术提高了1.5倍和6.9倍以上，具有很好的工业化应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物发酵工程
技术介绍
蛹虫草为子囊菌亚门Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科Clavicipitaceae、虫草属(Cordyceps)的模式种。学名为 Cordyceps militaris,又名北冬虫夏草、北蛹虫草、虫草等，由子座(即草部分)与菌核(即虫的尸体部分)两部分组成的复合体，世界性分布但天然资源数量很少。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚、腰膝酸痛、病后虚弱、久咳痰血、盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。大量的现代药理研究表明蛹虫草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值。其中虫草多糖是虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，因具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射及提高机体免疫功能、促进肾上腺的作用、增加人体胰岛素的分泌、降低糖尿病人的血糖水平等广泛的药理作用而倍受关注。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，能够活化巨噬细胞刺激抗体产生，促进淋巴细胞转化，提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力，临床已用于治疗恶性肿瘤。此外，虫草多糖还能改善呼吸系统，抗心律失常、抗心肌缺血、扩张外周血管、降压、降血脂、抑制血小板聚集等。目前世界范围内对蛹虫草及虫草多糖的需求增长迅速，而野生的蛹虫草中虫草多糖的含量不高，再加上人们的疯狂采摘，价格日益昂贵，蛹虫草多糖的广泛应用受到药源资源的严重制约，而且通过化学合成的途径工艺复杂且产量极低。采用液体发酵的方法生产蛹虫草多糖具有生产周期短、劳动力节省、受外部环境影响小等优点，而且研究发现从蛹虫草子实体、菌丝体及发酵液中得到的虫草多糖在生化结构上基本是相同的，因此被认为是一种有效的替代从天然蛹虫草提取多糖的生产方法。但目前蛹虫草多糖的发酵水平不高，产量偏低限制了其工业化生产的发展。与真菌多糖领域的大量研究相比，国内外对蛹虫草多糖的研究报道屈指可数，而且多集中在最近几年，主要集中在发酵及产物提取分离等工艺层面上。如专利文献CN101067005 (申请号200710052357)，公开了一种用大米生产虫草多糖方法，其包括配料、接种、培养、获取虫草多糖及辐照灭菌后包装步骤。所述配料中，各原料的配比是按重量计，大米45. 0 49. 0%，玉米和豆饼混合粉0. 9 2%，营养液49. 0 54. I %;营养液配方为土豆180 220g,白糖18 22g,蛋白胨13 18g,磷酸二氢钾I. 5 2.2g，硫酸镁0. 8 I. 2g，水900 llOOg。目前，尚未有从蛹虫草多糖生物代谢的角度分析的研究，对蛹虫草多糖发酵水平的提高有限，发酵周期长，成本高，整体的生产效率较低，还不能远满足现代工业化发酵生产的需要。扩张蛋白是近年在植物细胞壁中发现的一类新型蛋白，最先是从黄瓜下胚轴伸长区分离纯化得到，现已证明在燕麦胚芽鞘细胞壁、栝楼根尖细胞壁、番茄、烟草、拟南芥、水稻、棉纤维、玉米、大豆等细胞壁中也有扩张蛋白的存在，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞 壁中，与促进其细胞生理生长，影响营养生长、形态发生、授粉受精、果实软化等生理生长过程有关。利用重组细胞壁实验研究证实了扩张蛋白与以前发现的细胞壁蛋白不同，具有诱导热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，被推测能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，在植物生长过程中可能是生理调控和细胞壁松弛延伸的主要生理调节物质。但是，关于扩张蛋白的作用机制目前仍多是猜测和推断，国内外均未有明确的研究定论和机制阐明，因此对扩张蛋白的实际应用方面的报道甚少。将扩张蛋白应用于蛹虫草的液体发酵生产，用以提高虫草多糖产量等次生代谢产物产量的研究国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供。本专利技术技术方案如下—种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，包括如下步骤(I)将蛹虫草菌种接种到ro液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10 15%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为温度20 250C，摇床培养2 4天，得种子液；(2)将步骤(I)制得种子液按5 10%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20 25°C的条件下，液体发酵培养I 6天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.01 0. 85mg/mL，然后继续培养2 9天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中的ro液体发酵培养基，每升组分如下马铃薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中的活化培养条件为摇床转速100 160r/min，温度20 25°C，暗培养活化3 5天。根据本专利技术优选的，所述步骤(I)中的种子发酵培养基，每升组分如下3g葡萄糖、I. 5g酵母粉上清液、0. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig KH2P04、0. IgK2HPO4,2 5颗直径3 6_的玻璃珠。经种子发酵培养基培养后，菌球数量可提高60%以上、菌球直径缩小40%以上，菌丝松散均匀。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、1.5g 蛋白胨，0. Ig MgS04、0.03g CaCl2、0. IgKH2PO4、0.Ig K2HPO4。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0. 15 0. 7mg/mL ;进一步优选0. 25 0. 5mg/ml。最优选的,所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0. 5mg/mL。所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins thatinduce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液将大豆或黄瓜种子经0. 05 0. 15wt % HgCl2消毒4 6min,流水冲洗5 7h,然后，25 28°C暗培养4 6天；剪取幼苗下胚轴顶端3 4cm，置_20°C预冷0. 5h，加预冷至4°C的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70 y m的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置I 3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4°C下提取44 50h，过滤，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4) 2S04,添加(NH4) 2S04过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置45 50h，4°C条件下25000g离心5 IOmin,沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液经20000g离心lOmin，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。上述扩张蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚强，宫志远，单洪涛，韩建东，王琦，高能，孙涛，万鲁长，任鹏飞，赵军胜，曲玲，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业资源与环境研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。