高丝氨酸转运蛋白突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术利用体内连续定向进化方法，筛选获得了多种高丝氨酸外排能力增强的转运蛋白RhtA突变体，能够赋予宿主菌具有增强的高丝氨酸胁迫耐受能力，所述突变体相对于大肠杆菌野生型RhtA转运蛋白，存在A22V、P119L、T235I中一个或多个突变。实验表明分别过表达上述RhtA突变体，生产底盘菌的L

【技术实现步骤摘要】
高丝氨酸转运蛋白突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及外排能力增强的高丝氨酸转运蛋白突变体及其制备方法和在制备L
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高丝氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]L
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高丝氨酸是一种非必需手性氨基酸，是天冬氨酸家族衍生氨基酸(例如L
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苏氨酸、L
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甲硫氨酸和L
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异亮氨酸等)生物合成的重要前体，可广泛应用于食品、饲料、生物医药等领域。此外，L
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高丝氨酸可作为合成其他有前途的可再生平台化合物的重要中间体，其中包括L
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高丝氨酸内酯、γ
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丁内酯、四氢呋喃、异丁醇、1,4
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丁二醇、1,3
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丙二醇和2,4
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二羟基丁酸酯，以及环保型除草剂L
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草胺膦。尽管具有潜在的化学和生物学应用，但由于昂贵且复杂的合成过程，L
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高丝氨酸的大规模生产尚未实现商业化。目前L
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高丝氨酸的供应主要基于化学合成方法，然而存在着污染严重、催化成本高、耗时长、产量低等缺点，限制了生产规模和应用范围。近年来，随着系统代谢工程和合成生物学的进步，微生物发酵法因具有经济可行性和环境友好性等优点，在高效生产L
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高丝氨酸方面越来越受到关注，具有较大的研究价值。
[0003]大肠杆菌因其明确的基因背景、清晰的代谢网络、较短的生长周期而被广泛用于代谢产物的发酵生产。在大肠杆菌中L
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高丝氨酸的合成路径如下：首先，葡萄糖等碳源经过糖酵解后转化为磷酸烯醇式丙酮酸。一部分磷酸烯醇式丙酮酸被羧化为草酰乙酸的补充到柠檬酸循环中，另一部分转化为丙酮酸后以乙酰辅酶A的形式进入柠檬酸循环最后同样转化为草酰乙酸。以上两种方式产生的草酰乙酸经过天冬氨酸转氨酶作用后得到天冬氨酸。天冬氨酸经过天冬氨酸激酶(由thrA，metL，lysC基因编码)催化为β
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天冬氨酰磷酸，β
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天冬氨酰磷酸经天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)催化为L
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天冬氨酸
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β
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半醛，最后由高丝氨酸合成酶(由thrA，metL编码)催化为L
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高丝氨酸。最后，胞内生物合成的L
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高丝氨酸经过高丝氨酸转运蛋白系统，可以运出至胞外。
[0004]在高效底盘细胞工厂的设计构建过程中，转运蛋白的鉴定和工程化改造是提高宿主细胞生长和目标产物效价的有效途径。挖掘筛选增强的外排转运蛋白以降低产品的细胞内浓度有利于最大限度地减少胞内代谢抑制和提高生物制造效率。大肠杆菌中的氨基酸转运蛋白RhtA和RhtB以及谷氨酸棒杆菌中的氨基酸转运蛋白BrnFE，最初被证实可以向胞外转运L
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苏氨酸或支链氨基酸，但也可能参与L
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高丝氨酸的胞外泵出过程。但是，由于目前对这些潜在外排转运蛋白的生物学特性和生理作用的理解仍然不足，尚未能鉴定和获得一些更高效的外排转运蛋白突变体，限制了转运蛋白工程在微生物绿色制造中的有效应用

技术实现思路

[0005]基于上述要求，本专利技术的目的在于提供L
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高丝氨酸转运蛋白突变体，以使得其底物转运能力得到提升，利于微生物发酵生产高丝氨酸等代谢产物。
[0006]本专利技术提供一种来源于Escherichia coli MG1655的L
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高丝氨酸转运蛋白RhtA突
变体，其相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V，第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I，第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L中的一个或多个位点突变。
[0007]优选实施方式中，所述突变体相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，，仅第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V，第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I，第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L中的一个位点突变；或者仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V和第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I的组合突变；或者仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V和第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L的组合突变；或者仅存在第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I和第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L的组合突变；或者仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V，第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I和第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L的组合突变。
[0008]本专利技术进一步提供所述L
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高丝氨酸转运蛋白RhtA突变体的编码基因。优选地实施方式中，所述L
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高丝氨酸转运蛋白RhtA突变体编码基因的核苷酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。
[0009]本专利技术还提供含有所述的L
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高丝氨酸转运蛋白RhtA突变体编码基因的表达载体和宿主细胞。
[0010]本专利技术还提供所述的L
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高丝氨酸转运蛋白RhtA突变体或其编码基因或者所述的重组宿主细胞在制备L
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高丝氨酸中的应用。在具体实施方式中，培养导入含有所述的L
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高丝氨酸转运蛋白RhtA突变体编码基因的表达载体的微生物细胞以产生L
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高丝氨酸，进一步还包括收集和纯化L
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高丝氨酸的步骤。在一个更具体实施方式中，所述表达载体是低拷贝质粒pMW118，通过构建含有RhtA突变体编码基因的重组质粒，并将其导入大肠杆菌等微生物细胞中，用于发酵生产L
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高丝氨酸等代谢产物。在优选的实施方式中，本专利技术进一步提供了增强L
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高丝氨酸生产能力的底盘重组菌，其特征在于，其出发菌株中过表达所述的编码基因。优选地，所述出发菌株中敲除L
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高丝氨酸相关副产物合成途径基因metA(NCBI
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ProteinID:NP_418437)、thrB(NCBI
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ProteinID:NP_414544)、lysA(NCBI
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ProteinID:NP_417315)和poxB(NCBI
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ProteinID:NP_415392)，同时过表达L
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高丝氨酸生物合成途径基因thrA(NCBI
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ProteinID:NP_414543)。在实施方式中，其出发底盘菌可以是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌等，优选地为大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。
[0011]本专利技术利用体内连续定向进化方法，筛选获得了多种高丝氨酸外排能力增强的转运蛋白RhtA突变体，能够赋予宿主菌具有增强的高丝氨酸胁迫耐受能力，相对于大肠杆菌野生型RhtA转运蛋白，存在A22V、P119L、T235I中一个或多个突变。在具体实施方式中，分别本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来L
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高丝氨酸转运蛋白RhtA突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V，第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I，第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L中的一个或多个位点突变。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V，第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I，第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L中的一个位点突变；或者仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V和第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I的组合突变；或者仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V和第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L的组合突变；或者仅存在第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I和第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L的组合突变；或者仅存在第22位由丙氨酸A突变为缬氨酸V，第235位由苏氨酸T突变为异亮氨酸I和第119位由脯氨酸P突变为亮氨酸L的组合突变。3.如权利要求1或2所述突变体的编码基因。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘君，徐宁，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：