本发明专利技术公开了一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用，本发明专利技术利用单细胞测序技术对胃癌组织进行全外显子(基因组)测序和单细胞多组学(转录组)相结合的大分析，利用生物信息学算法工具对胃癌组织和胃癌的癌旁组织的全外显子和单细胞多组学测序数据进行分析，获得了一组对胃癌治疗有潜力新抗原候选序列，并利用主动免疫靶向激活技术平台(Active checkpoint targeted activated immunotherapy,ACTI)的纳米佐剂系统作为递送系统对新抗原进行改造，获得全新的主动免疫靶向激活技术的纳米治疗性疫苗ACTI，该疫苗可以高效的将免疫激活剂和肿瘤新抗原靶向递送到专职的抗原提呈细胞pDCs细胞中，精准激活机体的特异性免疫应答，启动体液免疫和细胞免疫进行胃癌治疗。启动体液免疫和细胞免疫进行胃癌治疗。启动体液免疫和细胞免疫进行胃癌治疗。
【技术实现步骤摘要】
一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用
[0001]本专利技术涉及一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用，属于生物
技术介绍
[0002]肿瘤免疫疗法近年来逐渐应用于胃癌的治疗中，该疗法是应用免疫学的原理和方法，通过激活机体免疫系统提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。肿瘤治疗性疫苗(Tumor Therapeutic Vaccine)是目前最热门的肿瘤免疫治疗疗法之一，肿瘤治疗性疫苗是一类多肽或者是重组蛋白片段，可以高效特异性的激活免疫系统，能够打破慢性感染者体内免疫耐受，重建或增强免疫应答，从而起到治疗肿瘤的效果，其基本原理是通过靶向肿瘤相关或肿瘤特异性的抗原肽，提升免疫系统对于含此类抗原肽的癌细胞的识别与杀伤能力，肿瘤治疗性疫苗能在有效避免健康细胞损伤的前提下激活免疫系统，具有很好的应用和开发前景。
[0003]发现和鉴定特异性的肿瘤抗原是肿瘤治疗性疫苗开发成功的关键，新抗原(neoantigen)是一类癌细胞在发生发展过程中产生的基因突变，这类突变可以激活免疫系统(能被免疫细胞所识别)、由癌细胞基因突变所产生的异常蛋白质(异常/特异性抗原)，新抗原的发现为肿瘤治疗性的疫苗的研发提供了新的方向。肿瘤免疫组学是指利用免疫基因组学、免疫蛋白质组学、免疫生物信息学等反映肿瘤免疫状态的多组学数据对TME进行的综合研究，它依赖于下一代测序技术的快速发展。高通量基因组和转录组数据可用于计算免疫细胞的丰度和预测肿瘤抗原，然而，由于批量测序代表了异质细胞群的平均特征，因此无法区分不同的细胞亚型。
[0004]另外治疗性疫苗的开发中选择合适的佐剂至关重要，免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能够增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的制剂，免疫佐剂是一种免疫调节剂，可增强抗原的免疫原性、提高免疫效果。佐剂作用机制是通过改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解和排出，从而延长抗原在体内的滞留时间，促进机体产生针对抗原特异性的体液与细胞免疫应答，涉及到抗原递呈细胞对抗原的摄取、抗原的处理以及抗原的递呈等方面。选择合适的免疫佐剂有效的递送新抗原是肿瘤治疗性疫苗开发成功的关键技术之一。佐剂可以根据其来源(天然、合成或内源性)、作用机制、物理或化学性质来进行分类。美国FDA在其发布的“Regulatory Considerations in the Safety Assessment of Adjuvants and Adjuvanted Preventive Vaccines”中将佐剂分3类:
①
增强抗原向抗原呈递细胞和/或淋巴结的传递，从而改善免疫反应，例如铝盐和油包水乳剂，如诺华公司的MF59、葛兰素史克公司的AS03系统以及其他脂质体；
②
免疫刺激剂或免疫增强剂，主要通过受体介导的信号通路来调节免疫反应的质量，如单磷酸脂质(MPL)、QS21、CpG、细胞因子等；
③
由
①
和
②
组合而成，称为佐剂系统(adjuvant system)，如葛兰素史克公司的AS04和
AS01。目前研究较多的佐剂包括寡聚核苷酸CpG、佐剂系统、活病毒载体和乳剂等。尽管各种新型的佐剂被陆续应用于临床，但是它们对免疫系统的作用机理到目前为止仍未完全明确。纳米医学的兴起为肿瘤疫苗的研发带来新的契机，纳米佐剂系统在抗原的靶向递送与可控缓释中发挥重要作用；同时也为免疫活化提供共刺激信号，发挥协同活化作用。通过纳米药物递送系统将抗原与佐剂精准递送至特异性免疫细胞已成为可能。结合纳米医学、结构生物学及免疫学前沿成果开发有效、安全，且易于生产的纳米载体疫苗是未来疫苗研发的最有前景的方向之一。
技术实现思路
[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于：提供一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，它解决了现有的批量测序代表了异质细胞群的平均特征，无法区分不同的细胞亚型的问题。
[0006]本专利技术所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，包括：胃癌患者肿瘤组织样本的收集、全外显子组测序(WES)、RNA测序、多肽序列表位的预测、新抗原预测、新抗原免疫原性的体外评估、流式细胞技术检测细胞因子的情况和IFN
‑
γELISPOT测定。
[0007]作为优选实例，在新抗原免疫原性的体外评估步骤中，包括将冷冻的人PBMC解冻并在添加有10％ FCS的AIM
‑
V培养基中培养，在培养基中加入25ng mL
‑1IL
‑
7(PeproTech)在第2天加入20U ml
‑1IL
‑
2(PeproTech)，每3天更换一半含有细胞因子的培养基，将2
×
105个PBMC接种在含有单个肽(25μg mL
‑1)的96孔细胞培养板中并孵育过夜，使用无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作阴性和阳性对照，对于抗原特异性T细胞的体外刺激，刺激1天后，收集细胞用于进一步的免疫分析，检测细胞因子的变化。
[0008]作为优选实例，在流式细胞技术检测细胞因子的步骤中，包括根据流式多因子检测技术(CBA)产品说明书(BD Biosciences)在体外刺激研究的培养物上清液中的IFN
‑
γ浓度，无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作空白(阴性)和阳性对照，将样品使用CytoFLEX LX流式细胞仪(Beckman Coulter)检测并分析数据，将合成的突变肽混合在一起刺激PBMC，对PBMC样品中的CD8+和IFN
‑
γ的变化进行检测和分析。
[0009]作为优选实例，在IFN
‑
γELISPOT测定步骤中，对于体外预刺激的PBMC，在用载有相应多肽的经辐照的自体PBMC过夜刺激后，使用IFN
‑
γELISPOT试剂盒(达科为)评估T细胞释放的IFN
‑
γ的分泌，包括预刺激PBMC(每孔105个)和装载有相应肽(1
‑
20μg mL
‑1)的经辐照自体PBMC以一式三份添加到孔中，在AIM
‑
V培养基中孵育18
‑
20小时，洗涤后，加入稀释的检测抗体，37℃孵育1小时，然后将链霉亲和素
‑
HRP(1:100稀释)和3
‑
氨基
‑9‑
乙基咔唑溶液混合物依次加入每个孔中，在室温下将培养板在黑暗中保持约20分钟后，加入去离子水以终止反应，在ELISPOT读取器(Cellular Technology Inc)下扫板，并使用ELISPOT软件(AID)分析数据。
[0010]本专利技术的有益效果是：本专利技术中利用单细胞测序本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：胃癌患者肿瘤组织样本的收集、全外显子组测序(WES)、RNA测序、序列的表位预测、新抗原预测、新抗原免疫原性的体外评估、流式细胞技术检测细胞因子的情况和IFN
‑
γELISPOT测定。2.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在新抗原免疫原性的体外评估步骤中，包括将冷冻的人PBMC解冻并在添加有10％FCS的AIM
‑
V培养基中培养，在培养基中加入25ng mL
‑1IL
‑
7(PeproTech)在第2天加入20U ml
‑1IL
‑
2(PeproTech)，每3天更换一半含有细胞因子的培养基，将2
×
105个PBMC接种在含有单个肽(25μg mL
‑1)的96孔细胞培养板中并孵育过夜，使用无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作阴性和阳性对照，对于抗原特异性T细胞的体外刺激，刺激1天后，收集细胞用于进一步的免疫分析，检测细胞因子的变化。3.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在流式细胞技术检测细胞因子的步骤中，包括根据流式多因子检测技术(CBA)产品说明书(BD Biosciences)在体外利用合成的突变多肽刺激后细胞上清液中的IFN
‑
γ浓度，无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作空白(阴性)和阳性对照，将样品使用CytoFLEX LX流式细胞仪(Beckman Coulter)检测并分析数据，将合成的突变肽混合在一起刺激PBMC，对PBMC样品中的CD8+和IFN
‑
γ的变化进行检测和分析。4.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在IFN
‑
γELISPOT测定步骤中，对于体外预刺激的PBMC，在用载有相应多肽的经辐照的自体PBMC过夜刺激后，使用IFN
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γELISPOT试剂盒(达科为)评估T细胞释放的IFN
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γ的分泌，包括预刺激PBMC(每孔105个细胞)和装载有相应肽(1
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20μg mL
‑1)的经辐照自体PBMC以一式三份添加到孔中，在AIM
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V培养基中孵育18
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20小时，洗涤后，加入稀释的检测抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁辉，刘斗，沈琦，程小涛，刘欣宇，章燕，
申请(专利权)人：苏州思萃免疫技术研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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