用于自中而下抗体表征的方法技术

本公开涉及用于抗体表征测序，诸如自中而下抗体表征和测序的新方法，例如用于从头抗体测序、鉴定样品中的已知抗体或验证样品中抗体的序列。在一些实施方案中，所述方法涉及将抗体暴露于组织蛋白酶D、组织蛋白酶L以及/或者组织蛋白酶D和组织蛋白酶L，随后进行质谱和序列鉴定以及解卷积。列鉴定以及解卷积。列鉴定以及解卷积。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于自中而下抗体表征的方法
[0001]相关申请案的交叉引用
[0002]本申请案主张2020年7月20日申请的美国临时申请案第63/053899号的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文。


[0003]本公开涉及抗体表征测序的新颖方法，诸如自中至下抗体表征和测序，例如，用于从头抗体测序、鉴定样品中的已知抗体或验证样品中的抗体的序列。在一些实施例中，这些方法涉及将抗体暴露于组织蛋白酶D、组织蛋白酶L和/或组织蛋白酶D和L，随后进行质谱法和序列鉴定和解卷积。

技术介绍

[0004]当前用于鉴定样品中的蛋白质序列(诸如抗体序列)的方法包括自下而上分析、自中至下分析和自上而下分析。在绝大多数情况下使用的自下而上分析中，通常可使用几种不同蛋白酶(例如4
‑
5种蛋白酶)以产生相对较短的重叠肽(例如9
‑
30个氨基酸长或约1
‑
5kDa)，用于液相色谱(LC)和质谱法(MS)分析。例如，如果执行此类方案以确定未知抗体的序列(即从头测序)，则必须产生大量质谱，且随后使用专门的测序程序进行组装，这些程序使用关于产物离子峰之间提取的质量偏移的信息。该方法的一个局限性为序列分析的准确性可能依赖于获得极高质量MS(例如串联式MS(MS/MS)裂解效率和低质量误差)数据以及检测跨越整个蛋白质的肽。此外，自下而上分析可对软件产生挑战，因为其可能需要将大量小肽的序列信息正确拼接在一起成为完整的蛋白质序列。使用少量肽或蛋白质片段的自中至下方法可能有助于缓解这些软件挑战。
>[0005]自中至下方法可用于抗体，例如，其中抗体首先在重链的CH1与CH2区域之间的铰链区附近或在其中被切割，以产生例如F(ab')2、F(ab')、Fc、Fd、VL
‑
CL片段。最常用的酶为来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的半胱氨酸蛋白酶IdeS，其在铰链区后被切割以产生F(ab')2片段和Fc/2片段。二硫键还原后，可产生轻链(LC)片段、Fd
’
片段和Fc片段，各片段的大小约为25kDa，长度约为200个氨基酸。
[0006]当使用普通MS仪器进行分析时，这些相对较长片段难以完全裂解，且因此可能不适合从头测序。例如，目前常用的MS仪器包括具有碰撞诱导解离的飞行时间仪器或Orbitrap
TM
高能碰撞解离(HCD)仪器，这些仪器缺乏电子诱导解离(一种高效的正交裂解方法)且缺乏紫外光解离(其也适用于极大的多肽)。因此，可能需要用自下而上的测序方法来补充仅提供有限覆盖范围的自中至下方法，以进行从头抗体测序。因此，需要替代的自中至下方法，其产生更适合常用的工业标准LC
‑
MS/MS CID和HCD仪器的蛋白质片段，且因此更实用。

技术实现思路

[0007]本专利技术尤其包括用于切割抗体的方法，其包括将抗体与组织蛋白酶L、组织蛋白酶
D或组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合混合以获得一个或多个抗体片段，其中该抗体包括轻链和重链，该轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，该重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，并且其中组织蛋白酶L和/或D在VL区与CL区之间和/或在VH区与CH区之间切割抗体以产生VL抗体片段和/或VH抗体片段和CL抗体片段和/或CH抗体片段。在一些实施例中，该方法还包括在切割后分离抗体片段中的一个或多个。在一些实施例中，该抗体片段在切割后不被分离。在一些实施例中，切割后，通过质谱法来分析一个或多个抗体片段。
[0008]例如，本专利技术还涵盖用于分析抗体序列的方法，其包括：(a)用组织蛋白酶L、组织蛋白酶D或组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合切割抗体以获得一个或多个抗体片段，其中该抗体包括轻链和重链，该轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，该重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，并且其中组织蛋白酶L和/或D在VL区与CL区之间和/或在VH区与CH区之间切割抗体以产生VL抗体片段和/或VH抗体片段和CL抗体片段和/或CH抗体片段；(b)在切割后任选地分离抗体片段中的一个或多个；以及(c)对一个或多个抗体片段进行质谱法(MS)分析。
[0009]在任何上述方法中，在一些实施例中，抗体为IgG抗体，例如人IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B或IgG4抗体。在一些实施例中，切割产生VL片段和/或VH片段。在一些此类实施例中，对VL片段和/或VH片段进行MS分析。在本文的一些方法中，重链恒定区至少包含CH1区，且任选地进一步包含铰链、CH2区和/或CH3区。在本文的一些方法中，抗体重链恒定区至少包含CH1、铰链和CH2区，且其中组织蛋白酶L和/或组织蛋白酶D进一步在CH1区与铰链之间切割抗体。
[0010]在一些实施例中，用组织蛋白酶L切割抗体。在一些实施例中，用组织蛋白酶D切割抗体。在一些实施例中，用组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合切割抗体。在一些情况下，还使用额外酶，诸如IdeS或另一蛋白酶。在其他情况下，用于切割的酶由组织蛋白酶L组成，由组织蛋白酶D组成，或由组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合组成。在一些情况下，该方法包括将抗体与组织蛋白酶L和组织蛋白酶D同时孵育。
[0011]在一些实施例中，进行切割以实现VL区与CL区之间以及VH区与CH区之间至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％切割。在一些情况下，进行切割以实现在铰链处或铰链下方至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％切割。在一些情况下，抗体为IgG抗体且经组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合切割，其中切割产生VL、VH、CL、CH1、CH2、CH3、CH2
‑
CH3、CL+CH1(键合)、F(ab')和F(ab')2片段。在一些实施例中，切割产生包含轻链CDR1、CDR2和CDR3中的每一者的片段，诸如VL、F(ab')或F(ab')2片段，和/或包含重链CDR1、CDR2和CDR3中的每一者的片段，诸如VH、F(ab')或F(ab')2片段。
[0012]在本文的一些方法中，通过将抗体与组织蛋白酶L、组织蛋白酶D或组织蛋白酶D和L的组合在pH 2
‑
8(诸如pH 2
‑
7、pH 2
‑
6、pH 3
‑
6、pH 3
‑
5、pH 2、pH 2.5、pH 3、pH 3.5、pH 4、pH 4.5、pH 5、pH 5.5、pH 6、pH 7或pH 8)下，在室温至50℃的温度下，且在不超过50％的有机溶剂(例如乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇)存在下一起孵育来进行切割，其中抗体处于天然状态。在本文的一些方法中，在一或多种浓度为0
‑
50％、5
‑
50％、5
‑
30％、0％
‑
30％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于切割抗体的方法，其包括：将所述抗体与组织蛋白酶L、组织蛋白酶D、或组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合进行混合以获得一个或多个抗体片段，其中所述抗体包含轻链和重链，所述轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，所述重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，并且其中所述组织蛋白酶L和/或组织蛋白酶D在所述VL区与CL区之间和/或在所述VH区与CH区之间切割所述抗体，以产生VL抗体片段和/或VH抗体片段以及CL抗体片段和/或CH抗体片段；以及任选地在所述切割之后分离所述抗体片段中的一个或多个。2.一种用于分析抗体的序列的方法，其包括：a.用组织蛋白酶L、组织蛋白酶D、或组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合切割所述抗体以获得一个或多个抗体片段，其中所述抗体包含轻链和重链，所述轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，所述重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，并且其中所述组织蛋白酶L和/或组织蛋白酶D在所述VL区与CL区之间和/或在所述VH区与CH区之间切割所述抗体，以产生VL抗体片段和/或VH抗体片段以及CL抗体片段和/或CH抗体片段；b.任选地在所述切割之后分离所述抗体片段中的一个或多个；以及c.进行对所述一个或多个抗体片段的质谱(MS)分析。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗体为IgG抗体，诸如人IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B或IgG4抗体。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述切割产生VL片段和/或VH片段。5.根据权利要求4所述的方法，其中对所述VL片段和/或VH片段进行MS分析。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述重链恒定区包含至少CH1区，并且任选地进一步包含铰链、CH2区和/或CH3区。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述抗体重链恒定区至少包含CH1、铰链和CH2区，并且其中所述组织蛋白酶L和/或组织蛋白酶D进一步在所述CH1区与所述铰链之间切割所述抗体。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗体是用组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合来切割。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括将所述抗体与组织蛋白酶L和组织蛋白酶D两者同时孵育。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中进行切割以便在所述VL区与CL区之间以及在所述VH区与CH区之间达到至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的切割。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中进行所述切割以便在所述铰链处或在所述铰链之下达到至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的切割。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述切割是按以下组织蛋白酶L和/或组织蛋白酶D与抗体比例进行的：1:20至1:2000、1:20至1:500、1:50至1:500、1:100至1:500、1:200至1:1000、1:200至1:2000、1:500至1:2000、1:1000至1:2000、或1:20、1:50、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、或1:1000。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗体为IgG抗体，并且是用组织
蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合来切割，其中所述切割产生VL、VH、CL、CH1、CH2、CH3、CH2
‑
CH3、CL+CH1(经键合)、F(ab')和F(ab')2片段。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中通过在pH 2至8(例如pH 2至7、pH 2至6、pH 3至6、pH 3至5、pH 2、pH2.5、pH 3、pH 3.5、pH 4、pH 4.5、pH 5、pH 5.5、pH 6、pH 7或pH 8)下、在室温至50℃的温度，并且在不超过50％的有机溶剂(例如乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇)存在下，将所述抗体与组织蛋白酶L、组织蛋白酶D、或组织蛋白酶D和组织蛋白酶L的组合一起孵育来进行切割，其中所述抗体处于天然状态。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述pH为3至5，例如3、3.5、4、4.5或5。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述pH为3.5至4.5。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述pH为4。18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中存在不超过30％的有机溶剂。19.根据权利要求14至18所述的方法，其中在10％至30％的有机溶剂(例如10％至30％的乙腈、10％至30％的甲醇、10％至30％的乙醇或10％至30％的异丙醇)存在下进行所述切割。20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中存在不超过10％的有机溶剂。21.根据权利要求14至20中任一项所述的方法，其中所述温度是在37℃与50℃之间。22.一种用于分析抗体的序列的方法，其包括：a.用组织蛋白酶L和组织蛋白酶D的组合切割所述抗体以获得一个或多个抗体片段，所述一个或多个抗体片段至少包含轻链可变区(VL)片段和/或重链可变区(VH)片段，i.其中所述抗体处于天然状态；ii.其中所述抗体包含轻链和重链，所述轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，所述重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，并且其中所述组织蛋白酶L和组织蛋白酶D在所述VL区与CL区之间和/或在所述VH区与CH区之间切割所述抗体，以产生VL抗体片段和/或VH抗体片段以及CL抗体片段和/或CH抗体片段；并且iii.其中在25℃与50℃之间的温度和pH 3至pH 5下，并且在不超过30％的有机溶剂存在下进行所述切割；b.任选地在所述切割之后分离所述抗体片段中的一个或...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：乌特勒支大学控股有限公司，
类型：发明
国别省市：