一种抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体及其筛选方法和应用。所述全人双特异性抗体由抗人FRα抗体和抗人VEGF抗体联合构建而成，其筛选方法简单，通过从卵巢癌患者来源的腹水中分选获得单个抗原特异性靶向的B细胞，最终构建了一个全新的双特异性抗体，所述抗体为来自人体的全人抗体，其免疫原性低，靶向性好，可以同时靶向FOLR1和VEGF，具有很好的肿瘤杀伤活性，能够抑制血管生成和肿瘤生成。成。成。

【技术实现步骤摘要】
一种抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于免疫学和生物
，具体涉及一种抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]卵巢癌是导致女性死亡率最高的一种癌症，65
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75％的卵巢癌患者在确诊时已经处于晚期(III期和IV期)，卵巢癌腹水是卵巢癌晚期的主要症状，卵巢癌腹水是肿瘤发生转移的表现。研究发现卵巢癌患者的腹水中含有多种类型的免疫细胞，腹水有可能是卵巢癌的Tertiary lymphoid structures(TLSs)，但目前还没有研究来阐明卵巢癌患者腹水中的免疫细胞在卵巢癌转移和恶化中的作用。
[0003]FRα由FOLR1编码，是分子量38
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40KD的细胞表面糖蛋白。FRα被证实在实体瘤中有广泛高表达，比如间皮瘤(72
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100％)，三阴性乳腺癌(35
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68％)，卵巢癌(76
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89％)，非小细胞肺癌(14
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74％)；而非恶性组织，只有肺部顶端支气管的上皮细胞，有一定比例的表达。FRα在恶性肿瘤的特异性表达，使之成为一个良好的抗肿瘤药物开发靶点。因而小分子药物、抗体药物、双特异性抗体、CAR
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T、ADC、叶酸
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细胞毒性药物偶联药物等不同形式的药物都在开发中。进展较快的如：Mirvetuximab soravtansine、Farletuzumab等均已经处于临床试验阶段。
[0004]血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的促血管生成因子，可在体内诱导血管的新生。VEGF在肿瘤生成和湿性黄斑变性等眼科疾病发生中扮演重要的角色。在多数恶性肿瘤如结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、神经胶质瘤、子宫癌、食管癌、胃癌、卵巢癌等组织中均检测到了VEGF及其受体的明显表达，且其表达水平与恶性肿瘤的发生、发展存在密切关系。VEGF是维持恶性肿瘤快速生长、促进其播散转移、预测患者生存预后的关键细胞因子。靶向VEGF的贝伐珠单抗在多重恶性肿瘤的临床治疗显示疗效，在妇科肿瘤治疗方面也已广泛应用。
[0005]与单克隆抗体不同，双特异性抗体具有同时靶向2个不同表位的能力，并能起到特殊的生物学功能，例如免疫细胞召集、受体共刺激或共抑制、多价病毒中和等。双特异性抗体根据结构左右对称性分为对称结构和不对称结构，根据IgG分子完整性分为类完整抗体和类抗体片段，以及根据抗原结合区域的数量构型分为两价、三价、四价或更多价的构型等。不同的双特异性抗体设计各有利弊，但是以临床治疗为目的的双特异性抗体设计都要解决同样的问题：第一，保证两对(或以上)不同轻链与重链的正确偶合或配对；第二，保持每个单克隆抗体各自结合域的独立性，同时结合不同表位的时候互相之间不会产生空间位阻的干扰；第三，抗体分子要易于用哺乳动物细胞进行表达，不需要复杂的蛋白修饰工艺，有较好的成药性。
[0006]构建并开发可以应用于临床治疗的双特异性抗体需要亟需解决以下几个问题：一是轻重链的正确配对，二是分子的成药性，三是要做到各个结合域不能互相干扰，最后还要注意免疫原性，尽量减少突变位点和额外的肽链，同时又能够利用现有的细胞及纯化工艺
进行高效规模化生产。现在国际上比较主流的双特异性抗体平台有DVDIg(艾伯维)、CrossMab(罗氏)、Duobody(GenMab)等。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体，所述全人双特异性抗体免疫原性低，靶向性好。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种全人双特异性抗体的筛选方法，其步骤简单，成功率高。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体的应用。
[0010]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0011]一种抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体，所述全人双特异性抗体由抗人FRα抗体和抗人VEGF抗体联合构建而成。
[0012]进一步的，所述抗人FRα抗体含有SEQ ID No.1所示的重链可变区序列和SEQ ID No.2所示的轻链可变区序列。
[0013]进一步的，所述抗人FRα抗体以单链抗体(scFv)形式表达，即重链可变区和轻链可变区表达在同一条多肽链中，中间以(GGGGS)3连接。
[0014]进一步的，所述抗人VEGF抗体含有SEQ ID No.6所示的重链可变区序列和SEQ ID No.5所示的轻链可变区序列。
[0015]进一步的，所述VEGF抗体以scFv形式表达，即重链可变区和轻链可变区表达在同一条多肽链中，中间以(GGGGS)3连接。
[0016]进一步的，所述抗人FRα的抗体重链可变区由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列编码；抗人FRα的抗体轻链可变区由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码。
[0017]进一步的，所述抗人VEGF的抗体重链可变区由SEQ ID No.8所示的核苷酸序列编码；抗人VEGF的抗体轻链可变区由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列编码。
[0018]进一步的，所述全人双特异性抗体中还含有序列如SEQ ID No.12所示的Fc突变体片段。
[0019]进一步的，所述Fc突变体片段由SEQ ID No.17所示的核苷酸序列编码。
[0020]进一步的，所述Fc突变体片段的突变位点包括S298A、T307A、E333A、K334A、E380A、N430A。
[0021]本专利技术还提供了所述的全人双特异性抗体的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
[0022](1)利用卵巢癌腹水筛选、富集抗原特异性B细胞；
[0023](2)从抗原特异性B细胞中，获取FRα抗体和VEGF抗体；
[0024](3)利用FRα抗体和VEGF抗体建立双特异性抗体平台，得到scFv形式的FRα抗体和VEGF抗体；
[0025](4)拼接scFv形式的FRα抗体和VEGF抗体，将Fc突变体片段Fcmu作为连接子，构建入载体，获取同时含有FRα(scFv)、Fcmu和VEGF(scFv)的质粒；
[0026](5)将质粒转入宿主细胞，筛选得到高表达的细胞株；
[0027](6)对高表达的细胞株培养纯化，得到同时含有FRα抗体、VEGF抗体和Fc突变体的
蛋白，即为全人双特异性抗体。
[0028]具体的，所述筛选方法包括以下步骤：
[0029](1)利采集卵巢癌患者术后腹水，经筛选、富集抗原特异性B细胞；
[0030](2)提取抗原特异性B细胞RNA，反转录得到cDNA，经巢式PCR扩增获取FRα和VEGF目的基因片段，通过双酶切将FRα和VEGF scFv基因片段连接到PCDNA3.1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗FOLR1/VEGF的全人双特异性抗体，其特征在于，所述全人双特异性抗体由抗人FRα抗体和抗人VEGF抗体联合构建而成。2.根据权利要求1所述的全人双特异性抗体，其特征在于，所述抗人FRα抗体含有SEQ ID No.1所示的重链可变区序列和SEQ ID No.2所示的轻链可变区序列。3.根据权利要求1所述的全人双特异性抗体，其特征在于，所述抗人VEGF抗体含有SEQ ID No.6所示的重链可变区序列和SEQ ID No.5所示的轻链可变区序列。4.根据权利要求1所述的全人双特异性抗体，其特征在于，所述抗人FRα抗体和所述抗人VEGF抗体均以scFv形式表达。5.根据权利要求2所述的全人双特异性抗体，其特征在于，所述抗人FRα的抗体重链可变区由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列编码；所述抗人FRα的抗体轻链可变区由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码。6.根据权利要求3所述的全人双特异性抗体，其特征在于，所述抗人VEGF的抗体重链可变区由SEQ ID No.8所示的核苷酸序列编码；所述抗人VEGF的抗体轻链可变区由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列编码。7.根据权利要求1所述的全人双特异性抗体，其特征在于，所述全人双特异性抗体中还含有序列如SEQ ID No.12所示的Fc突变体片段。8.根据权利要求7所述的全人双特异性抗体，其特征在于，所述Fc突变体片段由SEQ ID No.17所示的核苷酸序列编码。9.权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁辉，苏冰，刘斗，倪啸天，崔丹丹，伍宁波，刘欣宇，程小涛，
申请(专利权)人：苏州思萃免疫技术研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：