特异性启动抗乙型肝炎病毒T细胞免疫的双特异性抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开特异性启动抗乙型肝炎病毒T细胞免疫的双特异性抗体及其应用。本发明专利技术抗体包括抗HBs单链可变区和抗CD3ε的单链可变区，从N端到C端依次包含SP

【技术实现步骤摘要】
特异性启动抗乙型肝炎病毒T细胞免疫的双特异性抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种特异性启动抗乙型肝炎病毒T细胞免疫的双特异性抗体及其应用。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(HBV)的感染是全球卫生问题。
[0003]根据中国的慢乙肝诊疗指南，目前对慢乙肝提出3种不同层面的治疗目标，包括： (1)完全清除治愈：即血清HBsAg检测不到，同时肝细胞内HBV DNA包括肝内共价闭合环状DNA(cccDNA)和整合HBV DNA完全清除；(2)功能性治愈：即有限疗程结束后HBsAg和HBV DNA持续检测不到，伴或不伴HBsAb产生，肝组织病变改善，但肝内仍存在HBV DNA，仍有再激活和肝癌发生风险，是治疗的理想目标；(3)部分治愈：即有限疗程结束后血清HBV DNA持续检测不到，但血清HBsAg仍可检出。现已批准应用于慢乙肝临床治疗的抗病毒药物主要是干扰素和核苷(酸)类似物，这些药物仅可使约 1/3慢乙肝患者在治疗后达到部分治愈，多数患者停药后病毒反弹。HBV cccDNA在肝内的持续存在，免疫系统不能对其进行清除或有效抑制其转录活性是停药后反弹的根本原因。
[0004]一般认为，HBV感染后，患者体内的特异性抗病毒免疫强度决定疾病的发展方向。数量充足和功能健全的HBV特异性T细胞免疫可有效清除感染，而其数量不足和功能耗竭可使得感染持续而发展为慢性感染。鉴于上述共识，近年发展了若干增强慢乙肝患者抗HBV特异性细胞免疫的研究策略，包括：(1)免疫检查点抑制剂：大量病毒抗原刺激导致的特异性T细胞耗竭被认为是免疫耐受发生的机制之一，其中PD
‑
1及其配体在抗原介导的免疫细胞耗竭中起关键作用。目前有处于临床试验II期的ASC22(KN035或 Envafolimab)和I期的GS 4224，均为PDL1抑制剂。(2)治疗性疫苗：包括蛋白质疫苗，DNA疫苗及嵌合表位疫苗等。GS4774(Gilead Sciences)为表达4个HBV主要基因型表面抗原的融合蛋白，已进入II期临床，此外，NASVAC(CIGB)已进入临床III 期等。(3)工程化免疫细胞，通过基因工程技术将HBV特异性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CARs)在T细胞上表达，以重建慢乙肝患者的抗HBV特异性T细胞免疫。 TCR
‑
T细胞识别靶细胞为HLA限制性，而CAR
‑
T则可以突破HLA限制性，因此其应用人群更具普适性，目前处于临床II期的IMC
‑
I109V采用TCR
‑
T技术。但对于已经发生功能和数量耗竭的HBV特异性免疫细胞，上述免疫检查点抑制剂或治疗性疫苗对免疫系统的刺激对促进其功能恢复的作用有限。而工程化免疫细胞涉及对患者个体的T细胞提取，基因改造和回输等，难以形成标准化生产；且细胞治疗的生产工艺对生产车间，无菌操作，保存运输等有很高的要求，限制了其在临床的开展和应用。
[0005]双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)是近年发展的一种可以同时结合两种特异性表位的人工工程化抗体。相对于普通单抗的2个Fab臂相同特异性，只能结合单一靶点；BsAb拥有两个不同的抗原结合位点，可以同时和两个靶抗原或一个抗原两个不同表位结合。根据结构不同，可将BsAb总体上分为2大类：含Fc片段的IgG样 BsAb与不含Fc片段
的非IgG样BsAb。(1)IgG样BsAb有Fc部分，因此具有Fc介导的效应功能：如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用。IgG样BsAb相对分子量较大，且Fc部分与受体FcRn结合，增加了抗体血清半衰期。Fc部分亦有助于抗体后期的纯化并提高其溶解性、稳定性。(2)非IgG样BsAb：缺乏Fc片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性、分子量小等特点。因分子量小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果。作为新兴的抗体种类，双特异性抗体已纳入临床药物研究，目前主要集中于介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤研究，但尚未在慢性感染性疾病中临床应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一个目的是针对现有技术的不足，提出一种抗HBs
×
CD3ε的双特异性抗体(BsAb)。
[0007]本专利技术抗HBs
×
CD3ε的双特异性抗体包括抗HBs单链可变区和抗CD3ε的单链可变区，从N端到C端依次包含SP
‑
V
H
(anti
‑
HBs)
‑
Linker1
‑
V
L
(anti
‑
HBs)
‑
Linker2
‑ꢀ
V
H
(anti
‑
CD3ε)
‑
Linker1
‑
V
L
(anti
‑
CD3ε)；
[0008]上述anti
‑
HBs单链抗体结构域包括重链V
H
(anti
‑
HBs)和轻链V
L
(anti
‑
HBs)，其靶向位点为HBV的表面抗原表位结合，靶向表位可为表面抗原前S1区的第36
‑
43位氨基酸(PreS1)，或为表面抗原小蛋白区的第265
‑
336位氨基酸的抗原环(antigen loop)。
[0009]上述抗T细胞CD3ε分子的单链抗体结构域V
H
(anti
‑
CD3ε)和V
L
(anti
‑
CD3ε)序列来源于OKT3或UCTH1。
[0010]上述抗体结构域之间使用linker进行柔性连接，其中Linker1为3个G4S，Linker2 为1个G4S。
[0011]作为优选，在抗体的N端添加信号肽SP可促进其分泌，且在分泌后该序列自动切除，其氨基酸序列为MDMRAPAQIFGFLLLLFPGTRCD。
[0012]作为优选，抗HBs
×
CD3ε的双特异性抗体中HBs单链可变区V
H
(anti
‑
HBs)和轻链 V
L
(anti
‑
HBs)靶向HBV的S蛋白的36
‑
43氨基酸(5a19)，抗CD3ε的单链可变区 VH(anti
‑
CD3ε)和VL(anti
‑
CD3ε)来自CD3单克隆抗体OKT3，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
[0013]作为优选，抗HBs
×
CD3ε的双特异性抗体中HBs单链可变区V
H
(anti
‑
HBs)和轻链 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗HBs
×
CD3ε的双特异性抗体，其特征在于包括抗HBs单链可变区和抗CD3ε的单链可变区，从N端到C端依次包含SP
‑
V
H
(anti
‑
HBs)
‑
Linker1
‑
V
L
(anti
‑
HBs)
‑
Linker2
‑
V
H
(anti
‑
CD3ε)
‑
Linker1
‑
V
L
(anti
‑
CD3ε)；上述anti
‑
HBs单链抗体结构域包括重链V
H
(anti
‑
HBs)和轻链V
L
(anti
‑
HBs)，其靶向位点为HBV的表面抗原表位结合，靶向表位可为表面抗原前S1区的第36
‑
43位氨基酸，或为表面抗原小蛋白区的第265
‑
336位氨基酸的抗原环。上述抗T细胞CD3ε分子的单链抗体结构域包括重链V
H
(anti
‑
CD3ε)和轻链V
L
(anti
‑
CD3ε)序列来源于CD3单克隆抗体OKT3或UCTH1。2.如权利要求1所述的一种抗HBs
×
CD3ε的双特异性抗体，其特征在于Linker1为3个G4S，Linker2为1个G4S。3.如权利要求1或2所述的一种抗HBs
×
CD3ε的双特异性抗体，其特征在于信号肽SP的氨基酸序列为MDMRAPAQIFGFLLLLFPGTRCD。4.如权利要求1所述的一种抗HBs
×
...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘孝本，伍相佶，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：