四价对称双特异性抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种四价对称双特异性抗体，其结构为F(ab)2‑

【技术实现步骤摘要】
四价对称双特异性抗体
[0001]本申请是国际申请号为PCT/CN2019/095603，国际申请日为2019年7月11 日，进入中国国家阶段申请号为201980050120.3，进入中国国家阶段日期为2021 年1月27日，专利技术名称为“四价对称双特异性抗体”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及抗体领域。具体地，涉及双特异性抗体，包含其的药物组合物及其用途。

技术介绍

[0003]双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)为具有两种不同结合特异性的抗体或抗体类分子。双特异性抗体广泛应用于生物医学，尤其是针对肿瘤的免疫治疗中。
[0004]双特异性抗体可通过例如化学工程、细胞工程以及基因工程的方法制备。基因工程的优势在于能够容易地改造抗体，使得能够设计和生产许多不同形式的双特异性抗体片段，包括双特异性IgG(BsIgG)、附加IgG(appended IgG)、双特异性抗体片段(BsAb fragments)、双特异性融合蛋白(Bispecific fusion protein)和双特异性抗体偶联物(BsAb conjugates)五大类(参见Christoph Spiess,QiantingZhai,Paul J.Carter,Alternative molecular formats and therapeutic applications forbispecific antibodies.Molecular Immunology 67(2015)95
–/>106)。
[0005]第一类：双特异性IgG，具有与天然单抗相似的结构和分子量，但具有两个不同的Fab，(1)早期的Triomab技术通过将大鼠和小鼠的杂交瘤再融合形成“杂交
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杂交瘤”，从而产生小鼠大鼠嵌合双特异性抗体，根据大、小鼠Fc对亲和填料的选择性在纯化时获得目的产物，该技术存在表达量低，纯化收率低的缺点。 (2)后期通过抗体工程技术如亮氨酸拉链(Lucine zipper)、“杵入臼
”ꢀ
(Knobs
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into
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holes)或静电转向(electrostatic steering)改造Fc，使两个不同的重链形成异二聚体，再利用共同轻链(common light chain)、“杵入臼”或静电转向技术使轻
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重链正确配对，或者设计不同的轻链亚型κ链和λ链，利用分别对κ链和λ链特异性的亲和填料进行纯化获得正确的目的产物。这类双特异性抗体具有接近天然抗体的药代动力学，但存在杂质难以鉴定和去除的缺点。
[0006]第二类：附加IgG，以天然单抗IgG为骨架，在抗体重链或轻链的N端或C 端融合抗原结合结构域，如可变区片段(Fv)、单链可变区片段(ScFv)、抗原结合片段(Fab)或多肽等，该类双特异性抗体分子量大于150kDa，主要为对称结构，药代动力学类似天然抗体，甚至半衰期更长，纯化上具有一定便利，但存在表达量不高、分子不够稳定等缺点。
[0007]第三类：双特异性抗体片段，保留抗体可变区片段，缺失部分甚至全部的抗体恒定区，重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL)一般通过接头(linker) 蛋白连接形成ScFv，或者自发配对形成Fv。该类双特异性抗体分子量不超过 150kDa，半衰期短，存在表达量很难达到单抗水平，分子不够稳定，纯化收率低等缺点。
[0008]第四类：双特异性融合蛋白，保留抗体可变区片段，同时融合了其他蛋白或药物分
子，如T细胞受体恒定区、人血清白蛋白或毒素蛋白等。该类双特异性抗体分子量在75～160kDa之间，存在纯化工艺上的挑战，分子稳定性也有一定风险。
[0009]第五类：双特异性抗体偶联物，将两个不同的单抗或ScFv通过化学方法偶联在一起。该类抗体工艺复杂，最终收率低，目前国际上基本没有使用。
[0010]上述各类双特异性抗体均存在一些缺点，导致产品在临床使用上具有潜在的风险。为解除这些风险，本申请专利技术了一种新型双特异性抗体。

技术实现思路

[0011]本申请提供了一种新型双特异性抗体的构建及制备方法，具体结构见图1。本申请中的所有抗体都具有人IgG恒定区，属于附加IgG或双特异性抗体片段。
[0012]本申请对新型双特异性抗体的亲和力，稳定性，生物学活性和药效进行了检测，并与3种已有技术的双特异性抗体进行了对比，结果表明新型双特异性抗体具有更好的稳定性、生物学活性和药效，且表达和制备更为方便。
[0013]技术解决方案
[0014]本专利技术双特异性抗体具有2条相同的融合重链和2条相同的融合轻链，其中 2条融合重链形成配对，融合轻链和融合重链形成配对。
[0015]在某些方面，所述抗体的融合重链之间通过一个或多个二硫键结合。
[0016]在某些方面，所述抗体的融合轻链和所述融合重链之间通过一个或多个二硫键结合。
[0017]在某些方面，所述抗体的融合重链具有抗体a重链可变区(VHa)、第一恒定区(CH1)、抗体b轻链可变区(VLb)和Fc片段。其中VLb在CH1和Fc之间，通过接头或肽键连接。所述抗体的融合轻链具有抗体a轻链可变区(VLa)、轻链恒定区(CL)和抗体b重链可变区(VHb)。其中VHb在CL的C端，通过接头或肽键连接。
[0018]在某些方面，所述抗体的融合重链具有抗体a重链可变区(VHa)、第一恒定区(CH1)、抗体b重链可变区(VHb)和Fc片段。其中VHb在CH1和Fc 之间，通过接头或肽键连接。所述抗体的融合轻链具有抗体a轻链可变区(VLa)、轻链恒定区(CL)和抗体b轻链可变区(VLb)。其中VLb在CL的C端，通过接头或肽键连接。
[0019]在某些方面，VHa
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VLa配对针对抗原A具有特异性，该抗原A包括但不限于肿瘤细胞表面抗原，免疫细胞表面抗原，病毒，细菌，内毒素，细胞因子，例如CD3，SLAMF7，CD38，BCMA，CD16a，CEA，PD
‑
L1，PD
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1，CTLA
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4， TIGIT，LAG
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3，VEGF，B7
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H3，TGF
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β，IL
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10等。
[0020]在某些方面，VHb
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VLb配对针对抗原B具有特异性，该抗原B包括但不限于肿瘤细胞表面抗原，免疫细胞表面抗原，病毒，细菌，内毒素，细胞因子，例如CD3，SLAMF7，CD38，BCMA，CD16a，CEA，PD
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L1，PD
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1，CTLA
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4， TIGIT，LAG
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3，VEGF，B7
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H3，TGF
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β，IL
‑
10等。
[0021]具体地，在一个方面，本专利技术提供了双特异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双特异性抗体，其选自以下各项组成的组：(1)融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:60；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；(2)融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:60；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；(3)融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:59；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；(4)融合轻链包含SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:59；融合重链包含SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；(5)融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:27；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:120；(6)融合轻链包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:27；融合重链包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:74，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张敬，方丽娟，严永祥，曾亮，周鹏飞，
申请(专利权)人：南京友博迪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：