本发明专利技术公开了靶向PD
【技术实现步骤摘要】
靶向PD
‑
L1/HSA/CCL5三特异性纳米抗体及其衍生物和应用
[0001]本专利技术涉及治疗或诊断胰腺癌肿瘤的纳米抗体及其衍生物，尤其涉及靶向PD
‑
L1/HSA/CCL5三特异性纳米抗体及其衍生物，本专利技术进一步设计所述靶向PD
‑
L1/HSA/CCL5三特异性纳米抗体及其衍生物在制备诊断或治疗肿瘤的试剂或药物中的应用，属于治疗或诊断肿瘤的抗体领域。
技术介绍
[0002]胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，2020年，全球有超过46万人死于胰腺癌。根据《2020年全球癌症信息网》，胰腺癌是两性癌症相关死亡的第四大原因，5年生存率刚刚达到10％。一项针对28个欧洲国家的研究预测，到2025年，胰腺癌将成为癌症死亡的第三大原因。胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的胰腺癌类型，占胰腺癌的90％以上。但早期PDAC无明显症状，诊断困难。因此，大多数PDAC患者直到晚期才被发现，导致失去了早期手术治疗的机会。80
‑
90％的PDAC患者在诊断时都有不能切除的肿瘤。然而，对于那些接受根治性切除和辅助化疗的患者，5年生存率仍然很低。
[0003]在全世界常见的恶性肿瘤中，胰腺癌发病率位居第14位，死亡原因中居第7位，并且近年来，胰腺癌的发病率呈逐年升高趋势。全球癌症数据库统计结果显示，2018年全球有45万例胰腺癌确诊病例和43万例胰腺癌死亡病例。不同国家胰腺癌发病率差别较大，与发展中国家比较,发达国家的发病率较高。中国胰腺癌发病率在所有恶性肿瘤中位居第10位，死亡原因中居第5位。胰腺癌患者5年生存率约为6％，是预后最差的恶性肿瘤之一。绝大多数胰腺癌患者诊断较晚，只有20％的胰腺癌患者在诊断时具有可手术切除的条件，能够成功手术切除的患者的5年生存率为27％。鉴于胰腺癌持续上升的发病率和低存活率，认为确定筛查高危患者、早期诊断及改进治疗方法较为重要。
[0004]化疗，放疗，或两者联用是晚期胰腺癌的一线治疗方案。然而这些联用方案的治疗效果差强人意。免疫检查点抑制剂(ICI)为多种肿瘤的治疗开辟了新的途径，以程序性细胞死亡蛋白1(PD
‑
1)为代表的免疫检查点分子是机体免疫系统负调控的重要分子机制。肿瘤细胞通过高水平表达免疫检查点的配体分子，可以抑制T细胞等的免疫监视作用。针对这一机制，利用高亲和力的单克隆抗体阻断免疫检查点分子间的相互作用，从而恢复T细胞等杀伤细胞活性对抗肿瘤，成为新兴的肿瘤生物治疗研究热点。免疫检查点分子众多，目前应用研究最为成熟的是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA
‑
4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD
‑
1)，其中后者在临床应用中的应用尤为广泛(李婧.以PD
‑
1为代表的免疫检查点分子单抗在肿瘤治疗中的应用研究进展.2018)
[0005]但目前抗PD
‑
1/PD
‑
L1或抗CTLA
‑
4单抗治疗PDAC的效果并不理想。PD
‑
L1在PDAC中表达，其过度表达与预后不良有关。临床前研究表明，阻断PD
‑
L1可以在动物模型中抑制胰腺癌发展，提示PD
‑
1/PD
‑
L1通路可能成为治疗PDAC的潜在靶点。然而，临床试验表明，用单一药物靶向PD
‑
1/PD
‑
L1通路对PDAC患者的作用不大，这提示除了PD
‑
L1的表达外，还必须确定治疗PDAC的其他靶点。
[0006]本专利技术人最近的研究表明，癌症叉头盒蛋白3(Cancer
‑
FOXP3或C
‑
FOXP3)通过上调CCL5将Treg细胞招募到PDAC中，从而促进PDAC的免疫逃避。在这项研究中，本专利技术人证实PD
‑
L1在两个独立的根治性切除患者的PDAC样本中过表达。此外，C
‑
FOXP3与肿瘤细胞中PD
‑
L1的表达在mRNA和蛋白水平上是共定位的，并与PD
‑
L1在肿瘤细胞中的表达相关，这一发现得到了癌症基因组图谱数据库(TCGA)的证实。染色质免疫沉淀(ChIP)显示C
‑
FOXP3与胰腺癌细胞PD
‑
L1启动子区域直接结合。此外，C
‑
FOXP3的过表达激活了PD
‑
L1启动子控制下的荧光素酶报告基因。然而，结合基序
‑
a的突变完全逆转了荧光素酶的活性。此外，C
‑
FOXP3诱导的PD
‑
L1表达上调可有效抑制CD8+T细胞的活性。基于本专利技术人最近发现CCL
‑
5抗体对高C
‑
FOXP3水平的PDAC模型有较好的反应，本专利技术人进一步证明PD
‑
L1抗体增强了CCL
‑
5阻断在高C
‑
FOXP3水平的异种和原位小鼠模型中的抗肿瘤作用(张颖.趋化因子CCL5及其受体与自身免疫性疾病的研究进展.2016；李天明.肠道黏膜趋化因子研究进展.2020。
[0007]综上所述，C
‑
FOXP3直接激活PD
‑
L1是介导PDAC免疫逃逸的核心转录因子。联合阻断PD
‑
L1和CCL
‑
5可能为C
‑
FOXP3升高的PDAC患者提供一种有效的治疗方法，开发靶向CCL5和PDL1双特异性抗体在胰腺癌的治疗方面具有重要的意义。
[0008]现有传统全长抗体生物制剂均存在组织穿透性差、免疫原性强等问题，故而小型化、人源化、理性设计优化的抗体药物的开发和应用是今后治疗性抗体及诊断性抗体的发展方向。VHH纳米抗体(Nanobody)作为小型化抗体的杰出代表，具有亲和力高、特异性强、分子量小及免疫原性低和稳定性高这些优势。双特异性抗体(BsAb)是抗体发展的另一个趋势，其能够同时识别和结合两种不同的抗原或者表位，在治疗方面表现出了以下优势：双靶点信号阻断，发挥独特的或重叠的功能，有效防止耐药和免疫逃逸；具备更强特异性、靶向性和降低脱靶毒性；有效降低治疗成本。而纳米抗体容易通过基因工程的手段设计成多价和针对两个及两个以上抗原的功能形式。同时，纳米抗体容易通过计算机模拟的方式进行体外亲和力成熟从而获得高亲和力的抗体序列。将两个这种单价的小分子抗体连接在一起构建成双特异性单链纳米抗体可使其效能得到提高，显著增加对靶标的结合能力从而增加治疗能力，并延长其血清半衰期，双特异性纳米抗体已然成为近年来工程抗体研究的热点。目前获批及在研的双特异性纳米抗体主要集中在抗感染、肿瘤及免疫疾病治疗及诊断领域，其中以肿瘤治疗和诊断领域研究最为广泛。因此纳米抗体作为一种小型化抗体，具有分子量小、稳定性高、免疫原性低、易于连接等优点，在构建PD本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.靶向PD
‑
L1/HSA/CCL5三特异性纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列选自(1)
‑
(3)中的任何一种氨基酸序列：(1)SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示的任何一种氨基酸序列；或(2)将SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或(3)与SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.8所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。2.权利要求1所述靶向PD
‑
L1/HSA/CCL5三特异性纳米抗体的编码基因。3.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。4.含有权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞。5.将权利要求1所述的靶向PD
‑
L1/HSA/CCL5三特异性纳米抗体与与功能分子相缀合得到的衍生物。6.根据权利要求5所述的衍生物，其特征在于，所述功能分子包括但不限于小分子药物、细胞毒性药物、生物活性蛋白、放射性同位素或荧光染料中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：任贺，黄鹤，康广博，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。