本发明专利技术公开了一种去氢表雄酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体，同时本发明专利技术也公开了所述去氢表雄酮半抗原、人工抗原和抗体的制备方法和应用。本发明专利技术以去氢表雄酮为原料，与酸酐反应生成含羧基的去氢表雄酮半抗原；然后通过活泼脂法或者混合酸酐法将去氢表雄酮半抗原与蛋白质偶联制备去氢表雄酮人工抗原。将去氢表雄酮人工抗原免疫动物后产生对去氢表雄酮高特异性抗体。再将去氢表雄酮抗体与辣根过氧化物结合，得到辣根过氧化物标记的去氢表雄酮抗体。应用所述辣根过氧化物标记的去氢表雄酮抗体和去氢表雄酮人工抗原免疫检测方法可用于去氢表雄酮现场快速检测，对实现保健食品安全的快速检测具有重要现实意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种去氢表雄酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体，还涉 及上述去氢表雄酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体的制备方法和应用。
技术介绍
去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone， DHEA)化学名为3(3-羟基雄甾-5烯-17酮，分子量为288.4， CAS号为53-43-0，其结构式为<formula>formula see original document page 5</formula>去氢表雄酮是人体肾上腺与性腺分泌的一种C19类固醇素，具有雄性 激素作用，可提高体内的睾酮水平，是睾丸激素与雌激素的前体物质。研 究发现其可以阻止内脏脂肪的积累，增加肌肉胰岛素的抵抗力。经常使用 DHEA可能会改变脂肪酶的活性和(33受体激动剂的密度，而(33受体为G 蛋白偶联的跨膜受体，兴奋后能激动腺苷酸环化酶(AC)，使依赖cAMP 的脂肪酶活化，UCP表达增加，对胰岛素的敏感性增加。这些作用可以使 体重减轻，糖尿病症状改善。同时，由于DHEA具有拟甲状腺作用，因此 具有抑制食物和脂肪的摄入，同时可以增加能量消耗，刺激脂肪氧化，从 而起到一定的减肥作用，对肥胖者有一定的功效。但是从DHEA的安全性考虑，如果DHEA过多摄入会造成许多并发 症，如痤疮，女性容易获得男性第二性征以及减少女性体内HDL-C，使胰 岛素的敏感性和葡萄糖的忍受性受损。此外，饮用过量的DHEA会引起心 血管疾病，肝脏损害(主要包括肝脏肿大，肝脏器系数增大等)及某些性 激素相关的肿瘤发病增加等。1996年11月，去氢表雄酮被国际奥委会医 学委员会列入禁用药物名单。近年来，去氢表雄酮和其他内源性类固醇激 素的滥用已成为一个严重的问题。含DHEA的保健食品已出现在国内外市 场上。对保健食品中DHEA残留的检测目前主要采用高效液相色谱法 (HPLC)。然而应用HPLC时其方法的灵敏度受样品的净化、浓縮等步骤 的影响很大，测定方法复杂、繁琐，检测通量小，检测成本昂贵，不能实 现大批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检 测方法。免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，检测成本 很低，使用简单，适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全监管中发挥 了重要作用。目前，尚未有保健食品中去氢表雄酮的免疫学检测方法。本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种去氢表 雄酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体。本专利技术的另一目的在于提供所述去氢表雄酮半抗原及其相应的人工 抗原和抗体的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述去氢表雄酮半抗原及其相应的人工 抗原和抗体的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现一种去氢表雄酮半抗原的分子结构式为白蛋体载—Cn(H2C)COCT v v n为2 4的自然数。 所述的n优选为3。所述的载体蛋白为BSA (牛血清白蛋白)、KLH (血蓝蛋白)、CONA
技术实现思路
HOOCn(H2C)COOn为2 4的自然数。 所述的n优选为3。一种去氢表雄酮人工抗原的分子结构式为:(伴刀豆球蛋白)、THY (甲状腺球蛋白)或OVA (卵清蛋白)。一种去氢表雄酮抗体为能与去氢表雄酮人工抗原发生特异性免疫反 应的免疫球蛋白。所述去氢表雄酮抗体优选为辣根过氧化物标记的去氢表雄酮抗体。 所述去氢表雄酮半抗原的制备方法，包括以下步骤(1) 去氢表雄酮与酸酐按摩尔比1:1 1:8混合，加入无水吡啶至溶 解，同时加入与去氢表雄酮摩尔比为1:5 1:15的DMAP (1，4-二甲氨基吡 啶)作为催化剂，室温反应过夜；(2) 反应结束后加入5 15 ml的饱和盐水中，继续混匀5 20分钟； 水不溶性有机溶剂进行萃取，取水层，重复萃取至少3次；G)冷却水层，再用盐酸酸化水层，使其pH2 4，过滤，收集沉淀； (4)饱和盐水洗涤沉淀至中性，干燥，得到去氢表雄酮半抗原。 所述的酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或己二酸酐的一种。 所述饱和盐水为饱和氯化钠溶液或饱和碳酸钠溶液。 所述水不溶性有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲垸、二氯甲烷或石油醚。 所述去氢表雄酮人工抗原的制备方法为活泼脂法或混合酸酐法。 所述活泼酯方法包括以下步骤(1) 将30 50pmo1的去氢表雄酮半抗原溶解于1 2 ml 二甲基亚砜 (DMSO);(2) 在步骤(1)的溶液中分别加入与去氢表雄酮等摩尔的DCC (N， N-二环己基碳二亚胺)和NHS (N-羟基琥珀酸亚胺)，室温避光反应过夜；(3) 0 4。C离心，取上清液，将上清液缓慢加入到4 6ml0.1mol/L pH9.0 9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，然后在4。C下反应过夜；所述的碳 酸盐缓冲液含有载体蛋白，其中载体蛋白的浓度为10 20mg/ml;(4) 步骤(3)的溶液反应完成后，将其装入透析袋，再用生理盐水 透析，得到去氢表雄酮人工抗原。所述活泼脂法步骤(3)中的载体蛋白为BSA、 OVA、 KLH、 CONA 或THY。所述的混合酸酐法包括以下步骤(1) 将100 200pmo1去氢表雄酮半抗原溶于2 4ml二甲基甲酰胺 (DMF)中，再加入60 90nl正三丁胺，冰浴；(2) 接着，缓慢滴加0.1 0.2mmol氯甲酸异丁酯到步骤(1)的溶液中，0 4'C反应0.5 1小时，得到甲液；将60 80mg载体蛋白溶于4 6mllmol/LpH9.0 9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，得到乙液；将甲液缓 慢滴加到乙液中，4'C反应过夜；(3)步骤(2)的溶液反应完成后，将其装入透析袋，再用生理盐水 透析，得到去氢表雄酮人工抗原。所述混合酸酐法步骤(2)中的载体蛋白为BSA、 KLH、 CONA、 THY 或OVA。所述去氢表雄酮抗体的制备方法，具体步骤如下(1) 实验选用健康的雄性小鼠或雄性兔作为实验对象，免疫剂量基础免疫为0.25 lmg/kg，使用抗原与弗氏完全佐剂乳化免疫，加强免疫为 0.5 1 mg/kg，使用抗原与弗氏不完全佐剂乳化免疫。雄性兔子采用背部 皮下多点注射，雄性小鼠采用腹腔注射，基础免疫15 20天后进行加强 免疫，每隔15天加强免疫一次，第4次加强免疫后8 10天内，耳缘静 脉采血，测定效价和特异性，待其血清效价和特异性合格后，兔子采用心 脏采血，分离出抗血清；或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞， 进而获得单克隆抗体(刘秀梵，《单克隆抗体在农业上的应用》)；(2) 采用辛酸-硫酸铵法或采用蛋白A亲和层析法，得到兔抗血清或 是小鼠腹水中的免疫球蛋白G;所述的免疫球蛋白G是去氢表雄酮抗体。所述去氢表雄酮抗体的制备方法步骤(1)中的雄性小鼠优选为雄性 Balb/c小鼠，雄性兔优选为雄性新西兰兔。所述的去氢表雄酮抗体特异性、效价、亲和力高。所述辣根过氧化物标记的去氢表雄酮抗体的制备方法为过碘酸盐氧 化法，纯化方法同所述去氢表雄酮抗体的制备方法步骤(2)。所述的去氢表雄酮抗体应用于去氢表雄酮含量的免疫检测。所述的去氢表雄酮特抗体应用于食品中去氢表雄酮含量的免疫检测， 特别是应用于减肥类保健食品中去氢表雄酮含量的免疫检测。所述的免疫检测为酶联免疫吸附剂测定(即ELISA)。本专利技术的原理由于去氢表雄酮是小分子物质(分子量小于1000)， 本身本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种去氢表雄酮半抗原，其特征在于分子结构式为： ＨＯＯＣｎ（Ｈ↓［２］Ｃ）ＣＯＯ＊＊＊ ｎ为２～４的自然数。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：雷红涛，孙远明，石敏，沈玉栋，杨金易，王弘，徐晓艳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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