高效细胞电转染缓冲液及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种高效细胞电转染缓冲液及其制备方法。本发明专利技术在传统的电转染缓冲液中添加三磷酸腺苷二钠盐可以防止经过电转后的细胞的细胞质泄露，有助于细胞膜上的穿孔闭合。加入碳酸氢钠可以维持缓冲体系的稳定，增强对细胞的保护从而增加细胞存活。另外加入的葡萄糖可以为细胞增加营养也可以增加细胞存活率。与传统的电转染缓冲液相比，本发明专利技术可以提高外源基因在目标细胞的电转染效率并能提高细胞存活率。本发明专利技术的配置方法简单，经济实惠，适用于多种电转染仪器。适用于多种电转染仪器。适用于多种电转染仪器。

【技术实现步骤摘要】
高效细胞电转染缓冲液及其制备方法、应用


[0001]本专利技术涉及电转染培养基
，具体涉及一种高效细胞电转染缓冲液及其制备方法。

技术介绍

[0002]细胞转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。转染大致可分为化学介导、生物介导和物理介导三类途径。化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法和多种阳离子物质介导的技术。生物介导方法包含较为原始的原生质体转染和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。物理方法则包含电穿孔法、显微注射和基因枪。
[0003]脂质体转染方法是目前用的最多的转染方法，脂质体通过包裹DNA形成DNA/脂质体复合物，之后细胞通过内吞的方式将DNA转入细胞内。当遇到某些脂质体转染效率很低或几乎无法转入时建议用电穿孔法转染。电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内。一般情况下，高电场强度会杀死50％
‑
70％的细胞。因此针对细胞死亡开发出降低细胞的死亡率并提高电穿孔转染效率的电转缓冲液是非常有必要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于公开了一种哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，与传统的电转缓冲液相比具有转染率高、细胞存活率高的优点。
[0005]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种高效细胞电转染缓冲液的制备方法，包括如下步骤：
[0007]S1：配置溶液I，其成分及浓度如下所示：
[0008]三磷酸腺苷二钠盐0.2g/ml；
[0009]六水合氯化镁0.12g/ml；
[0010]配置完成后过滤除菌并分装成80ul/管，
‑
20度保存；
[0011]S2：配置溶液II，其成分及浓度如下所示：
[0012]磷酸二氢钾0.6g/50ml；
[0013]碳酸氢钠0.06g/50ml；
[0014]葡萄糖0.02g/50ml；
[0015]用NaOH调节pH至7.4、终体积50ml，配置完成后过滤除菌并分装成4.2ml/管，
‑
20度保存；
[0016]S3：为确保转染缓冲液质量，使用前需先取200ul solutionII，向其中加入1ml孵育好的培养液并观察其是否变色，若变色说明pH值发生变化则无法使用；若不变色则将80ul溶液I与4ml溶液II混合均匀，分装成100ul/管，电转一个样本需要用一管；
[0017]S4：配置的电转缓冲液可以4度保存一个月。
[0018]第二方面，本专利技术提供一种高效细胞电转染缓冲液，所述电转染缓冲液由如权利要求1的方法制备得到，包含如下浓度的组分：
[0019]溶液I：三磷酸腺苷二钠盐0.2g/ml；六水合氯化镁0.12g/ml；
[0020]溶液II：磷酸二氢钾0.6g/50ml；碳酸氢钠0.06g/50ml；葡萄糖0.02g/50ml。
[0021]第三方面，本专利技术提供一种如上述高效细胞电转染缓冲液的应用，所述电转染缓冲液应用于哺乳动物细胞电转染过程。
[0022]所述的细胞是体外培养的哺乳动物细胞。
[0023]电转缓冲液由溶液I和溶液II按照比例混合配制而成。
[0024]将所述电转染缓冲液重悬待电转染的细胞，然后加入外源基因载体，经混合得到电转染体系。
[0025]所述的电转染的外源基因载体为DNA片段。
[0026]具体展开来说，本专利技术的高效细胞电转染缓冲液制备方法，工艺步骤如下：
[0027]1.配置溶液I，其成分及浓度如下所示：
[0028]三磷酸腺苷二钠盐0.2g/ml
[0029]六水合氯化镁0.12g/ml
[0030]配置完成后过滤除菌并分装成80ul/管，
‑
20度保存。
[0031]2.配置溶液II，其成分及浓度如下所示：
[0032]磷酸二氢钾0.6g/50ml
[0033]碳酸氢钠0.06g/50ml
[0034]葡萄糖0.02g/50ml
[0035]用NaOH调节pH至7.4(终体积50ml)，配置完成后过滤除菌并分装成4.2ml/管，
‑
20度保存。为确保转染缓冲液质量，使用前需先取200ul solutionII，向其中加入1ml孵育好的培养液并观察其是否变色，若变色说明pH值发生变化则无法使用。若不变色则将80ul溶液I与4ml溶液II混合均匀，分装成100ul/管，电转一个样本需要用一管。配置的电转缓冲液可以4度保存一个月。
[0036]相较于现有技术，本专利技术的优点及有益效果如下：
[0037]添加的三磷酸腺苷二钠盐可以防止经过电转后的细胞的细胞质泄露，有助于细胞膜上的穿孔闭合。加入碳酸氢钠可以维持缓冲体系的稳定，增强对细胞的保护从而增加细胞存活。另外加入的葡萄糖可以为细胞增加营养也可以增加细胞存活率。本专利技术与传统的电转染缓冲液相比减少了数种试剂仍然可以达到理想的电转染效果，降低了电转染成本。
附图说明
[0038]图1为电转染三种细胞后EGFP阳性细胞比例的结果示意图。
[0039]图2为电转染三种细胞后细胞存活率的结果示意图。
具体实施方式
[0040]以下结合附图与具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步地详细阐述。
[0041]实施例1：pEGFP
‑
C1质粒转化及扩增
[0042]1.从
‑
80℃超低温冰箱中取出感受态细胞，置于冰上备用。
[0043]2、取一个1.5ml的EP管，向其中加入5
×
KCM溶液、转化质粒、无菌水，最后加入50μl的感受态细菌，轻轻吹打将体系混匀。
[0044]3、将EP管先置于冰上20分钟，然后在常温环境下放置10分钟。
[0045]4、加入500μl无菌无抗生素的LB培养基，转移至37℃摇床上摇菌40分钟。
[0046]5、4000rpm离心5分钟，将上清吸出约500μl并丢弃，轻轻吹打重悬。
[0047]6、将菌液涂布到有相应抗性的LB平板上，倒置于37℃培养箱过夜。
[0048]7、从上一步的平板中挑取单个菌落，置于10ml的相应抗性的LB中，在
[0049]37℃摇床上摇菌12到18小时。
[0050]8、用无内毒素质粒试剂盒提取质粒，具体步骤可参照试剂盒说明书。
[0051]实施例2：HEK293T细胞转染质粒
[0052]1、复苏HEK293T细胞系(中国典型培养物保藏中心)，将细胞放入培养瓶
[0053]中加10％的FBS+DMEM于37℃、5％ CO2的培养箱中进行培养。
[0054]2、转染前配置溶液I和溶液II。
[0055]3、吸出培养瓶中培养基，加入PBS洗涤并舍弃，加入适量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化细胞，细胞脱离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效细胞电转染缓冲液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：配置溶液I，其成分及浓度如下所示：三磷酸腺苷二钠盐0.2g/ml；六水合氯化镁0.12g/ml；配置完成后过滤除菌并分装成80ul/管，
‑
20度保存；S2：配置溶液II，其成分及浓度如下所示：磷酸二氢钾0.6g/50ml；碳酸氢钠0.06g/50ml；葡萄糖0.02g/50ml；用NaOH调节pH至7.4、终体积50ml，配置完成后过滤除菌并分装成4.2ml/管，
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20度保存；S3：为确保转染缓冲液质量，使用前需先取200ul solutionII，向其中加入1ml孵育好的培养液并观察其是否变色，若变色说明pH值发生变化则无法使用；若不变色则将80ul溶液I与4ml溶液II混合均匀，分装成100ul/管，电转一个样本需要用一管；S4：配置的电转缓冲液可以4度保存一个月。2.一种高效细胞电转染缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘实，朱应，聂龙宇，黄玙，佘应龙，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：