一种内寄生蜂的基因沉默方法技术

本发明专利技术公开了一种通过针刺破蛹、壳内点滴的纳米点滴法对体型微小的内寄生蜂进行基因沉默的方法。本发明专利技术的方法巧妙地借助昆虫即将羽化前的保护罩—蛹壳，通过刺破蛹壳滴入dsRNA，再借助纳米材料渗透进入虫体，从而为一类体型微小、内部寄生、无法有效注射的昆虫提供了一种基因干扰方法，也供其他昆虫开展相关技术研究提供新的方式。技术研究提供新的方式。

【技术实现步骤摘要】
2020, 65:293
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311），通常难以实现。浸泡法是将试验材料直接浸泡在候选基因的dsRNA溶液中而引起RNAi的方法，这种方法也称为细胞外RNAi，显然绝昆虫并不适合浸泡法的操作。饲喂法通常将dsRNA与昆虫饲料混合，通过昆虫的主动取食消化吸收来实现RNA干扰的目的，采用饲喂法进行昆虫的RNA干扰，具有省力、省时和易于操作等优点（Tian et al., Transgenic cotton plants expressing double
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stranded RNAs target HMG
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CoA reductase(HMGR) gene inhibits the growth,development and survival of cotton bollworms．Int. J. Biol. Sci., 2015,11(11):1296
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1305），且对于个体比较小的昆虫不易对其造成机械损伤而提高存活率（Yang et al., MAPK
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directed activation of the whitefly transcription factor CREB leads to P450
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mediated imidacloprid resistance. PNAS,2020, 117(19):10246
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10253），也更利于后续的实验开展。然而很明显，对于特定昆虫而言，饲喂法也存在其不易克服的缺点，第一，昆虫个体如果未取食，则不能实现其RNA干扰的目的；第二，每头昆虫根据自己的饥饿程度和取食需要进行饲料摄取，因此取食进去的dsRNA量不一致，会导致个体间干扰效率的巨大差异。
[0005]丽蚜小蜂Encarsia formosa属膜翅目（Hymenoptera）蚜小蜂科（Aphelinidae），是一种专性寄生粉虱类害虫的内寄生蜂，雌蜂会把卵产在粉虱若虫体内，孵化后以若虫为食，最终导致若虫死亡。国内外广泛将丽蚜小蜂应用于保护地蔬菜、花卉等作物的粉虱类害虫防控上并取得优良防效，成为全球生物防治的典范（Liu et al., Whitefly parasitoids: distribution, life history, bionomics, and utilization. Annu. Rev. Entomol., 2015, 60: 273
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292 ；王玉波等，丽蚜小蜂及配套措施联合控制技术对温室粉虱的防治效果.河北农业科学, 2015,19(2):36
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40, 55）。为了研究丽蚜小蜂搜寻和寄主定位的嗅觉相关基因、毒液蛋白、免疫基因等相关基因的功能，有必要采用RNAi技术开展相关研究，但丽蚜小蜂成虫体型微小、善飞、无法固定，其卵期和幼虫期均在寄主粉虱的若虫体内生活，这些都不利于开展其RNAi技术的实施。有研究采用饲喂法进行昆虫的RNA干扰，但由于取食的不确定性常常导致干扰结果的不稳定。而且，截至目前，尚未有关于丽蚜小蜂RNAi技术方面的较为成熟的研究报道。毋容置疑，这与丽蚜小蜂体型微小（成虫体长约0.5 mm）、体壁脆弱、寄主体内寄生、不易采用显微注射等特性密切相关，这也极大阻碍了该寄生蜂功能基因的深入研究。因此，研究建立一套适合于内寄生蜂的、可简便操作的、较为稳定的RNA干扰技术和方法，对于研究害虫关键基因的功能极为重要。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对内寄蜂策小个体的特点，建立了一套适合于内寄生蜂的、可简便操作的、较为稳定的RNA干扰技术和方法，对于研究害虫关键基因的功能极具重要意义。
[0007]本专利技术提供一种对内寄生蜂进行基因沉默的方法，其包括如下步骤：（1）制备点滴液：根据靶标基因的序列设计和合成dsRNA，使用纳米材料溶液对靶标基因的dsRNA进行稀释至终浓度得到dsRNA混合液；（2）挑选蜂蛹：先体式显微镜下检查内寄生蜂的蛹，挑选生理状态一致的丽蚜小蜂蛹；（3）制备针管：将毛细玻璃针管的针头制成10
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20度的倾斜角；（4）吸取点滴液：向毛细玻璃针管内注入dsRNA混合液；
Inhibitor0.5 μL，T7 RNA Polymerase2 μL，并用无RNAase的水补足至总体积20 μL。在37
°
C孵育30 min，室温放置10 min，缓慢冷却形成dsRNA；随后加入 RNase
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Free DNase I于37
°
C孵育、离心、漂洗等过程，合成dsOBP26和dsEGFP，使用前采用Nanodrop测定浓度。
[0027]采用纳米点滴法进行丽蚜小蜂的RNAi试验。采用的试虫为预计在24
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48 h内即将羽化的丽蚜小蜂蛹，点滴液由纳米材料（Star polycation，SPC）（Shen et al., 2021）和dsRNA混合而成。将供试丽蚜小蜂分成两组，处理组点滴dsRNA溶液，对照组点滴dsEGFP溶液；每处理组设置三次重复，每重复处理丽蚜小蜂150
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200头。
[0028]使用SZX10显微镜（Olympus, Japan）与InjectMan 4显微注射仪（Eppendorf, Hamburg, Germany）配合进行干扰试验的操作，显微注射仪压强设置为150 hPa，注射时间和防回吸压强分别设置为0.5 s和5 hPa。具体操作过程如下（图1）。
[0029]（1）制备点滴液：根据靶标基因的序列设计和合成dsRNA，使用纳米材料（Star polycation，SPC）（Yan et al., Chronic exposure to the star polycation (SPc) nanocarrier in the larval stage adversely impairs life history traits in Drosophila melanogaster. Journal of Nanobiotechnology, 2022，20(1):515）溶液对靶标基因的dsRNA进行稀释，分别配制500 ng/mL、1000 ng/mL的终浓度。
[0030]（2）挑选蜂蛹：先体式显微镜下检查丽蚜小蜂的蛹，挑选生理状态一致的丽蚜小蜂蛹，并将干瘪的、空壳的、畸形的、未被寄生的等非正常蛹壳以及背部朝下和体姿不正常的蛹壳，使用解剖针小心去除。
[0031]（3）拉制针管：毛细玻璃管采用 P
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97 micropipette拉针仪（Sutter Instrument, Novato, CA, USA）进行拉制获得，并使用EG
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401 microgrinder (Narishige, Tokyo, Japan)磨针器进行针头处理，使其针头有15度左右的倾斜角。
[0032]（4）吸取点滴液：采用10 ml艾本德Micro本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对内寄生蜂进行基因沉默的方法，其包括如下步骤：（1）制备点滴液：根据靶标基因的序列设计和合成dsRNA，使用纳米材料溶液对靶标基因的dsRNA进行稀释至终浓度得到dsRNA混合液；（2）挑选蜂蛹：先体式显微镜下检查内寄生蜂的蛹，挑选生理状态一致的丽蚜小蜂蛹；（3）制备针管：将毛细玻璃针管的针头制成10
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20度的倾斜角；（4）吸取点滴液：向毛细玻璃针管内注入dsRNA混合液；（5）针头破蛹：采用毛细玻璃针管的针头将即将羽化的丽蚜小蜂适龄蛹壳挑破；（6）点滴蜂蛹：注射仪从用毛细玻璃针头挑破的蛹壳小孔处滴入dsRNA混合液；（7）恒温培养：将内寄生蜂蛹放入培养箱中进行培养至羽化。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第（2）中将干瘪的、空壳的、畸形的、未被寄生的等非正常蛹壳以及背部朝下和体姿不正常的蛹壳，使用解剖针小心去除。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第（3）中毛细玻璃管采用 P
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97 micropipette拉针仪进行拉制获得，并使用EG
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【专利技术属性】
技术研发人员：王少丽，王克，张友军，郭兆将，吴青君，谢文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：