一种提高透膜多肽基因转染效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高透膜多肽基因转染效率的方法，是在透膜多肽固相合成过程中，在其肽链上引入(VGVAPG)

【技术实现步骤摘要】
一种提高透膜多肽基因转染效率的方法


[0001]本专利技术属于基因领域，具体涉及一种提高透膜多肽基因转染效率的方法。

技术介绍

[0002]基因治疗是一种非常有前途的预防和治疗多种疾病的策略，包括癌症、传染病、心血管等疾病的预防治疗。但基因治疗的有效应用还需要克服一些障碍，如低细胞毒性和高转染效率的基因递送载体的开发，递送的基因在细胞中的摄取、内体逃逸和核转运。目前的基因传递系统主要由病毒和非病毒载体组成。病毒载体效率较高所以在基因传递中占主导地位，占临床试验所用载体的70％以上。但病毒载体存在安全性问题，如免疫原性、无法快速清除；另外病毒载体制造成本较高。而非病毒载体则有安全性高、易于生产和使用方便等优点。常见的非病毒载体包括无机纳米粒子、脂质体、高分子、多肽及复合体系等。
[0003]透膜多肽(cell
‑
penetrating peptide,CPP)是一类非病毒载体，由大约5
‑
30个氨基酸组成。透膜多肽可降解，易于合成和修饰，并且能够方便地与核酸形成非共价复合物用于细胞的基因转染。透膜多肽可以穿透细胞膜并通过能量依赖性或非能量依赖性机制将各种活性物质输送到细胞中。最常见的透膜多肽是HIV
‑
1Tat肽，它已被应用于药物、蛋白质和DNA的细胞递送。虽然透膜多肽研究取得一定进展，可以成功递送基因进入并转染细胞，但目前透膜多肽的转染效率与病毒载体、高分子载体或脂质体类载体相比还是偏低。
[0004]为了提升透膜多肽的转染效率，通常的方法是优化主链序列，提升多肽与核酸的结合能力及进入细胞后的内膜逃逸能力。如RALA是由近年开发的一种基因递送透膜多肽(N
‑
WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA
‑
C)，它来源于融合肽，包括富含谷氨酸的GALA(N
‑
WEAALAEALA EALAEHLAEA LAEALEALAA
‑
C)和富含赖氨酸的KALA(N
‑
WEAKLAKALA KALAKHLAKA LAKALKACEA
‑
C)。它已被开发用于宫颈癌DNA疫苗载体，以及RNAi递送的载体。为提高透膜多肽的内膜逃逸能力，有研究人员将RALA中的精氨酸替换为组氨酸，设计了一系列多肽命名为HALA，如HALA2(N
‑
WEARLARALA RALARHLARA LAHALHACEA
‑
C)。但这些改性方法在提升透膜多肽的细胞转染效率方面取得的效果依然有限。
[0005]针对透膜多肽转染效率不高的问题，有研究(Proc Natl Acad Sci U S A 2016,113,E291
‑
299；Biomaterials 2019,216,119277)通过在透膜多肽上引入能与细胞膜表面糖胺多糖位点结合的多肽序列，可以增强透膜多肽与细胞的相互作用，从而提升透膜多肽的基因递送效率。如研究(Proc Natl Acad Sci U S A 2016,113,E291
‑
299)采用21个氨基酸的肽段靶向糖胺多糖；但是，该研究是利用基因重组的大肠杆菌合成多肽，步骤繁琐、耗时长、成本高。如研究(Biomaterials 2019,216,119277)利用固相合成法合成多肽，采用长度为16个氨基酸的肽段靶向糖胺多糖；但是，由于固相合成多肽的长度不能过长，否则合成难度和提纯难度越高，产率越低，因此，靶向细胞表面受体的肽段越长，要保持原透膜多肽原有序列，势必增加合成难度和提纯的难度；如果缩短原透膜多肽的序列，降低合成及提纯的难度，那么就会削弱透膜多肽结合核酸的能力。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、安全、高效的提高透膜多肽基因转染效率的方法。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种提高透膜多肽基因转染效率的方法，是在透膜多肽固相合成过程中，在其肽链上引入(VGVAPG)
n
肽段，得到(VGVAPG)
n
改性的透膜多肽。
[0009]具体的，所述提高透膜多肽基因转染效率的方法，包括下述步骤：
[0010](1)溶胀树脂：在反应器中加入透膜多肽固相合成的树脂，清洗树脂并溶胀，沥干；然后在反应器中加入脱保护试剂，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
[0011](2)氨基酸的偶联反应：将带保护基的氨基酸、多肽缩合剂溶解，然后加入反应器中，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
[0012](3)脱保护反应：在反应器中加入脱保护试剂，然后震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；
[0013](4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到完成含(VGVAPG)
n
肽段的改性透膜多肽的合成；
[0014](5)将合成的含(VGVAPG)
n
肽段的改性透膜多肽从树脂上切除下来，然后纯化、冷冻干燥，得到干态的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽。
[0015]优选的，所述(VGVAPG)
n
肽段的氨基酸数量在6～108个之间。
[0016]优选的，步骤(2)和步骤(3)中，反应温度在15～30℃之间，压力为常压。
[0017]优选的，步骤(1)中，透膜多肽包括但不限于RALA (WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA)，GALA(WEAALAEALA EALAEHLAEA LAEALEALAA)，KALA(WEAKLAKALA KALAKHLAKA LAKALKACEA)，HALA系列多肽(如HALA2:WEARLARALA RALARHLARA
‑
LAHALHACEA)，聚赖氨酸L
n
(n在1
‑
40之间)，聚精氨酸R
n
(n在1
‑
40之间)，R
n1
H
n2
R
n3
(n1，n2，n3在0
‑
8之间)，R
n1
W
n2
R
n3
(n1，n2，n3在0
‑
8之间)，K
n1
H
n2
K
n3
(n1，n2，n3在0
‑
8之间)，Mu peptide(MRRAHHRRRR ASHRRMRGG)，Protamine sulfate(RSSSRPVRRR RRPRVSRRRR RRGGRRRR)，Tat多肽(GRKKRRQRRR PPQ)，R
n
(n在3
‑
40之间)，Penetratin(RQIKIWFQNR RMKWKK)，PenArg(RQIKIWFQNR RMKWRR)，PenLys(KQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：是在透膜多肽固相合成过程中，在其肽链上引入(VGVAPG)
n
肽段，得到(VGVAPG)
n
改性的透膜多肽。2.根据权利要求1所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)溶胀树脂：在反应器中加入透膜多肽固相合成的树脂，清洗树脂并溶胀，沥干；然后在反应器中加入脱保护试剂，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；(2)氨基酸的偶联反应：将带保护基的氨基酸、多肽缩合剂溶解，然后加入反应器中，震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；(3)脱保护反应：在反应器中加入脱保护试剂，脱除保护基团，然后震荡，沥干；再清洗树脂，沥干；(4)重复步骤(2)、步骤(3)，进行后续氨基酸的偶联反应和脱保护反应；直到合成含(VGVAPG)
n
肽段的改性透膜多肽；(5)将合成的含(VGVAPG)
n
肽段的改性透膜多肽从树脂上切除下来，然后纯化、冷冻干燥，得到干态的含(VGVAPG)n肽段的改性透膜多肽。3.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：所述(VGVAPG)
n
肽段的氨基酸数量在6～108个之间。4.根据权利要求2所述的提高透膜多肽基因转染效率的方法，其特征在于：步骤(1)中，透膜多肽包括：RALA(WEARLARALA RALARHLARA LARALRACEA)，GALA(WEAALAEALA EALAEHLAEA LAEALEALAA)，KALA (WEAKLAKALA KALAKHLAKA LAKALKACEA)，HALA系列多肽，聚赖氨酸L
n
(n在1
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40之间)，聚精氨酸R
n
(n在1
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(n1，n2，n3在0
‑
8之间)，R
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(n1，n2，n3在0
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8之间)，K
n1
H
n2
K
n3
(n1，n2，n3在0
‑
8之间)，Mu peptide(MRRAHHRRRR ASHRRMRGG)，Protamine sulfate(RSSSRPVRRR RRPRVSRRRR RRGGRRRR)，Tat多肽(GRKKRRQRRR PPQ)，R
n
(n在3
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40之间)，Penetratin(RQIKIWFQNR RMKWKK)，PenArg(RQIKIWFQNR RMKWRR)，PenLys(KQIKIWFQNK KMKWKK)，Pep
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【专利技术属性】
技术研发人员：严乐平，罗亮，
申请(专利权)人：中山大学附属第七医院深圳，
类型：发明
国别省市：