一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种链霉菌

【技术实现步骤摘要】
一种链霉菌
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霉菌混合发酵合成
ε
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聚赖氨酸的工艺


[0001]本专利技术涉及一种促进ε
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聚赖氨酸合成的方法，具体地说是将小白链霉菌和霉菌进行混合培养，采用调节阳离子交换树脂包在发酵液中的浸没率，使得阳离子交换树脂能够吸附发酵液中超出浓度范围的ε
‑
聚赖氨酸，从而以ε
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聚赖氨酸浓度调控霉菌生长，进而使霉菌在全发酵阶段持续合成微生物信号分子以刺激小白链霉菌高效合成ε
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聚赖氨酸的方法，属于工业生物


技术介绍

[0002]ε
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聚赖氨酸是一种含有25
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35个赖氨酸残基的同型单体聚合物，具有广泛的抑菌谱、良好的热稳定性、高效的抑杀菌能力及绿色安全无毒害的特性。其被美国FDA认定为GRAS(总体安全)化合物，并在2014年获得我国卫计委批准作为食品防腐剂在食品加工产业中使用。目前，ε
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聚赖氨酸主要作为一种绿色安全的生物食品防腐剂在中国、日本、美国、欧盟、韩国得以应用。此外，ε
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聚赖氨酸还能够作为药物载体、高吸水聚合物、脂肪酶抑制剂、生物芯片在医药、保健及卫生用品中使用，具有较大的市场潜力。现阶段制约ε
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PL应用的主要原因在于其生产成本过高(市售￥1500kg
‑1)，提高ε
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PL的生物合成水平是解决该问题的重要手段。
[0003]在此问题上，学术界和产业界做了大量研究工作，其研究主要集中在优良发酵菌种选育、发酵培养基优化、基于pH及氧气供给的发酵过程调控等方面。在菌种选育方面，目前工作主要集中在通过传统诱变偶联细胞融合手段筛选耐受一定胁迫的ε
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PL高产菌株；在发酵培养基优化方面，目前工作主要集中在优化培养基中的碳氮源或在发酵中添加重要的中间代谢物及前体；在发酵过程调控方面，业界主要围绕着强化传质传氧、动态调节发酵pH等方面进行调控。以上工作主要目标在于提高菌种在发酵中的耐受性、保障产物合成所需要的物质能量需求。然而，针对“小白链霉菌为何要合成ε
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聚赖氨酸”这一根本问题尚未有相应的研究及相关技术开发。本课题组前期研究发现，霉菌细胞提取物能够大幅促进ε
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聚赖氨酸的合成。本课题组对部分霉菌细胞中的诱导物进行了提取，并在ε
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聚赖氨酸发酵中添加，开发出了基于霉菌菌体提取物添加的发酵技术。然而，此技术有着其固有瓶颈：(1)霉菌的培养过程需要消耗培养基、电力、人工，同时带来相应的有机发酵废水；(2)霉菌诱导物提取工艺繁琐，有机溶剂消耗大，溶剂回收需消耗能量，带来了额外试剂及能量成本；(3)霉菌菌体提取物中的生物诱导子会被ε
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聚赖氨酸产生菌不断降解，其激活ε
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聚赖氨酸合成的作用主要表现为添加后的48h，发酵中后期的促进效果不明显。
[0004]解决以上问题的方法在于将ε
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聚赖氨酸产生菌(小白链霉菌)和诱导子产生菌(霉菌)进行共培养发酵，使得霉菌不断合成诱导子并持续激活小白链霉菌的ε
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聚赖氨酸合成能力。然而，ε
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聚赖氨酸具有广泛的抑菌谱，在较高浓度下，能够完全抑制绝大多数细菌、酵母和霉菌的生长；反过来，霉菌生长速度比链霉菌快得多，且对ε
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聚赖氨酸具有一定抗性，在没有或低浓度ε
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聚赖氨酸环境中能够快速生长进而在发酵中占据优势，使得ε
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聚赖氨酸无法合成。
[0005]专利技术人经大量实验及分析认识到，“调控发酵液中的ε
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聚赖氨酸浓度”是解决该问题的关键。本专利技术采用动态添加阳离子交换树脂包的方式调控发酵液中的ε
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聚赖氨酸浓度，使得其浓度能处于刚好限制霉菌快速生长又不会完全杀死霉菌的适宜范围。此方法可使得霉菌在ε
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聚赖氨酸发酵液中处于适宜的丰度，以持续合成诱导子，进而获得持续激活小白链霉菌合成ε
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聚赖氨酸的有利效果。相比传统ε
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聚赖氨酸发酵和产物原位提取发酵工艺，此方法能显著提高产物产量；相比霉菌菌体提取物添加发酵，此方法此方法省去了提取诱导子的环节，同时活性霉菌能够持续合成生物信号分子以促进ε
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聚赖氨酸合成，具有重要的工业应用价值。

技术实现思路

[0006]为省去诱导子提取环节，并持续提供能够促进小白链霉菌合成ε
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聚赖氨酸的生物诱导子，本专利技术以发酵液中ε
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聚赖氨酸浓度为调控把手，采用阳离子交换树脂包动态浸没的方式对ε
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聚赖氨酸浓度进行调控，进而调控霉菌生长速率，使其与ε
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聚赖氨酸产生菌保持适宜的菌群丰度比例，以持续合成生物诱导子并长期促进小白链霉菌合成ε
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聚赖氨酸。本专利技术方法不仅可以显著提高ε
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聚赖氨酸发酵产量，还可大幅减少培养霉菌细胞、提取诱导子、处理相关废水、诱导物精密流加控制所需成本，在ε
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聚赖氨酸工业化生产中具有重要的应用价值。
[0007]本专利技术链霉菌
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霉菌共培养合成ε
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聚赖氨酸的工艺，是以小白链霉菌IFO14147(StreptomycesalbulusIFO14147，CICC11022)为ε
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聚赖氨酸生产菌，以其他多种霉菌为诱导菌，两者在同一培养基、同一发酵条件下进行共培养合成ε
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聚赖氨酸；在共培养的过程中，采用阳离子交换树脂包浸没发酵液以控制体系中ε
‑
聚赖氨酸浓度，利用ε
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聚赖氨酸对霉菌的抑制作用，选择适宜的ε
‑
聚赖氨酸浓度控制霉菌生长，进而霉菌持续合成可促进小白链霉菌合成ε
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聚赖氨酸的生物诱导子，最终获得发酵产量的提升。
[0008]本专利技术链霉菌
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霉菌共培养合成ε
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聚赖氨酸的工艺，包括如下步骤：
[0009]步骤1：菌种活化
[0010]将小白链霉菌孢子涂布于固体贝塔纳培养基上，在恒温培养箱中30℃恒温培养8
‑
10天，待孢子生长成熟；
[0011]将不同霉菌孢子涂布于PDA培养基，在恒温培养箱中30℃恒温培养8
‑
10天，待孢子生长成熟；
[0012]所述不同霉菌包括产黄青霉、米根霉、黑根霉、华根霉、米曲霉、紫色红曲、黑曲霉中的一种或多种。
[0013]步骤2：发酵种子培养
[0014]刮取2
‑
3环小白链霉菌孢子(约1
×
107个)接种于装有60mLM3G培养基的500mL三角瓶中，在30℃的条件下于恒温震荡培养箱中200rpm培养1
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种链霉菌
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霉菌共培养合成ε
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聚赖氨酸的工艺，其特征在于：以小白链霉菌IFO14147为ε
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聚赖氨酸生产菌，以其他多种霉菌为诱导菌，两者在同一培养基、同一发酵条件下进行共培养合成ε
‑
聚赖氨酸；在共培养的过程中，采用阳离子交换树脂包浸没发酵液以控制体系中ε
‑
聚赖氨酸浓度，利用ε
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聚赖氨酸对霉菌的抑制作用，选择适宜的ε
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聚赖氨酸浓度控制霉菌生长，进而霉菌持续合成可促进小白链霉菌合成ε
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聚赖氨酸的生物诱导子，最终获得发酵产量的提升；所述不同霉菌包括产黄青霉、米根霉、黑根霉、华根霉、米曲霉、紫色红曲、黑曲霉中的一种或多种；所述阳离子交换树脂包括Amberlite IRC
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50、HD
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2、D004或D152。2.根据权利要求1所述的链霉菌
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霉菌共培养合成ε
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聚赖氨酸的工艺，其特征在于包括如下步骤：步骤1：菌种活化将小白链霉菌孢子涂布于固体贝塔纳培养基上，在恒温培养箱中30℃恒温培养8
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10天，待孢子生长成熟；将不同霉菌孢子涂布于PDA培养基，在恒温培养箱中30℃恒温培养8
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10天，待孢子生长成熟；步骤2：发酵种子培养刮取2
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3环小白链霉菌孢子接种于装有60mL M3G培养基的500mL三角瓶中，在30℃的条件下于恒温震荡培养箱中200rpm培养1
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2天；刮取2
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3环不同霉菌孢子接种于装有80mLM3G培养基的500mL三角瓶中，在30℃的条件下于恒温震荡培养箱中200rpm培养1
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3d；步骤3：阳离子交换树脂改性将阳离子交换树脂置于三角瓶中，依次使用5倍树脂体积的1mol/L氨水、1mol/L盐酸、1mol/L氨水溶液，在摇床30℃，200rpm振荡4h，每次碱酸碱改性后均需要用去离子水多次洗涤树脂至洗涤水溶液pH值8.5；改性后的阳离子交换树脂以网笼介质包裹后获...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾昕，朱洺志，泰宝艳，唐慧，苏志伟，李珊珊，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：