一种酶促法生产肌肽的方法技术

本分案申请公开了一种酶促法生产肌肽的方法，包括以下步骤：(1)在反应罐中合成肌肽的反应；(2)在过滤器中分离肌肽合成酶和ATP再生酶：通过超滤方法，将步骤(1)的反应体系的反应液经过过滤器分离肌肽合成酶、ATP再生酶和AK酶，滤出液为分离出酶之后的反应液，通过离子交换层析等方式进一步纯化；检测到回收的酶，可添加相应新酶后再次用于步骤(1)反应。本发明专利技术具有如下有益效果：1)使用腺苷替代ATP或AMP，为工业生产节约了大量成本；2)建立了稳定的酶回收体系，节能环保；3)少量生成的副产物ATP、ADP及AMP或直接用于循环反应，或用于生产ATP，或集中通过过滤、离子交换等方法进行纯化，操作简单。操作简单。操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种酶促法生产肌肽的方法
[0001]本申请是申请日为2017年6月15日、申请号为201710453365.3、专利技术名称为“一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法”的专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，具体涉及一种酶促法生产肌肽的方法。

技术介绍

[0003]三磷酸腺苷(ATP)由一个腺苷和三个磷酸基团组成，分子量为507，分子式C
10
H
16
N5O
13
P3。它是生物能量的转换器和贮存器，在利用和转换能量的酶促反应中，起着不可替代的重要作用。
[0004]由于目前ATP成本偏高，在工业生产中直接使用ATP进行酶促反应收益甚微。因此，能够在反应生产中投入少量的ATP，通过建立稳定、有效的ATP再生体系，使ATP在反应过程中循环利用是目前利用ATP进行工业化生产的研究方向。
[0005]工业上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途径，进行底物水平磷酸化方式再生ATP。此法参与催化反应的酶众多，反应过程复杂，反应过程不易控制，产品批次间质量差异较大。同时酵母酶系质量常因供应的厂家不同、批次不同、甚至季节不同而有很大差异。另外反应过程需要加入大量的酵母细胞酶液，引入了许多蛋白、色素等杂质给后期纯化带来一定困难。近年来，ATP再生的研究重点转向使用单一酶或较简单的酶系，获得高效稳定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，这些酶所利用的底物价值昂贵，如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸；且生成的副产物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反应的产物分别为乙酸和氨气，因此较难在工业生产中大量使用。
[0006]专利CN201610268246.6利用多聚磷酸或其盐作为磷酸和能量供体，使用多聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)和多聚磷酸
‑
腺苷酸磷酸转移酶(PAP，EC 2.7.4.
‑
，有文献报道该酶也属于PPK酶中的一类，但IUBMB对该酶分类尚不十分明确)三种“ATP再生酶”合理组合，再生ATP，并应用于多种需ATP的酶促反应。此方法反应底物价格相对低廉，产物污染较小，适用于工业化生产。但使用此方法仍需加入一定量的ATP进行酶促反应。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，具体为酶促法生产肌肽的方法，该方法可进一步降低生产成本，即在原有含有ATP再生酶的反应体系中添加腺苷激酶(AK，EC 2.7.1.20)，该酶可催化腺苷生成AMP，组合上述其它ATP再生酶，可不使用ATP，仅添加少量腺苷即可进行酶促反应，是该领域一项重大革新。
[0008]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0009]一种利用腺苷代替ATP进行酶促反应的生产方法，所述酶促反应为需要ATP的酶促反应，包括以下步骤：
[0010](1)在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷进行酶促反应：
[0011]通过基因工程改造、发酵、纯化获得ATP再生酶和AK酶，或以自然提取等其它方式获得ATP再生酶和AK酶。ATP再生酶和AK酶可以游离酶的形式制成酶液或者干粉；也可进一步固定于固定化载体上，制得固定化ATP再生酶和AK酶。
[0012]在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶和AK酶，并添加腺苷代替ATP进行酶促反应。其中所述反应体系为含有腺苷、多聚磷酸或其盐以及镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液。另外，反应体系中还可包含钾离子、钠离子、铵离子的一种或几种，Tris和磷酸根离子的一种或几种。本专利技术添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
[0013](2)固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离，游离的ATP再生酶和AK酶通过过滤器中超滤膜分离：
[0014]固定化的ATP再生酶和AK酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离，也可在反应柱中直接分离。或
[0015]游离的ATP再生酶和AK酶通过滤器中超滤膜分离。其中，过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留的超滤膜。经过滤器的截留液为回收的酶液，滤出液为分离出酶之后含产物的反应液。
[0016](3)将步骤(2)滤出液进行分离、纯化，获得产物。
[0017]优选地，上述技术方案中，所述方法还包括以下步骤：
[0018](4)回收ATP再生酶和AK酶，并重复利用于步骤(1)中进行反应；
[0019](5)反应生成的少量ATP、ADP或AMP通过过滤或离子交换方法分离，生产ATP；或回收ATP、ADP或AMP，并重复利用于步骤(1)中进行反应。
[0020]优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，ATP再生酶和AK酶为固定化酶或游离酶，AK酶浓度为0.01
‑
8000U/L，其中将1μM底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)；ATP再生酶为多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸
‑
腺苷酸磷酸转移酶(PAP)的任意两种或三种组合，即使用PPK和ADK组合，或ADK和PAP组合，或PPK和PAP组合，或PPK、ADK和PAP的组合；酶添加量PPK酶浓度为0.01
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5000U/L，ADK酶浓度为0.01
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5000U/L，PAP酶浓度为0.01
‑
5000U/L。上述的ATP再生酶和AK酶可来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
[0021]优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)的反应条件如下：
[0022]反应温度为25
‑
60℃，优选温度为30
‑
50℃；
[0023]反应pH为5
‑
10，优选pH为6
‑
9；
[0024]反应体系包括：腺苷；多聚磷酸或其盐；镁离子、锰离子中的一种或两种组合；
[0025]在酶促反应体系中，按比例添加ATP再生酶和AK酶，进行酶促反应。
[0026]优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)的反应还包括：
[0027]铵离子、钾离子或钠离子的一种或几种组合；Tris或磷酸根离子的一种或两种组合；其中，钾离子浓度为0.01
‑
0.5M；钠离子浓度为0.01
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0.5M；铵离子浓度为0.01
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0.3M；Tris浓度为0.01
‑
0.1M；磷酸盐浓度为0.01
‑
0.1M。
[0028]优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中腺苷浓度为0.01
‑
20g/L；多聚磷酸或其盐的浓度为0.01
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶促法生产肌肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在反应罐中合成肌肽的反应：在反应罐中，100L的反应体系为含有底物1.8kg L
‑
组氨酸、1.0kgβ
‑
丙氨酸，以及0.25kg腺苷、1.0kg多聚磷酸钠、0.3kg氯化钠、0.38kg氯化钾、1.0kg六水氯化镁和0.6kg磷酸氢二钠的溶液，配制时均匀搅拌防止出现沉淀；调节pH值至8.0，在反应体系中添加1000U/L肌肽合成酶及600U/L ADK酶、600U/L PAP酶、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘珊珊，刘辉，周稳文，秦永发，
申请(专利权)人：北京天开易达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：