pldⅡ在提高ε-聚赖氨酸聚合度中的用途和方法技术

本发明专利技术涉及生物发酵提取及应用，特别是涉及pldⅡ在提高ε

【技术实现步骤摘要】
pldⅡ在提高
ε
‑
聚赖氨酸聚合度中的用途和方法


[0001]本专利技术涉及生物发酵提取及应用，特别是涉及pldⅡ在提高ε
‑
聚赖氨酸聚合度中的用途和方法。

技术介绍

[0002]ε
‑
聚赖氨酸(ε
‑
poly
‑
L
‑
lysine，ε
‑
PL)是一种氨基酸聚合物，由L
‑
赖氨酸的α
‑
羧基和ε
‑
氨基连接而成，一般含有25～35个L
‑
赖氨酸残基，等电点约为9.0，不具有明显的二级和三级结构。ε
‑
聚赖氨酸易溶于水，吸湿性强，在高温和酸、碱性条件下都很稳定。由于ε
‑
聚赖氨酸具有抑菌谱广、抑菌效率高、稳定性好、安全性高等特点，在食品工业和医药工业上应用广泛。
[0003]目前，ε
‑
聚赖氨酸只能通过微生物发酵法生产，在工业上ε
‑
聚赖氨酸通常是由白色链霉菌合成。从葡萄糖出发经糖酵解、三羧酸循环途径合成草酰乙酸，通过二氨基庚二酸途径在天冬氨酸激酶、二氨基庚二酸酯脱羧酶等关键酶的介导下合成L
‑
赖氨酸，最后通过位于细胞膜上的ε
‑
聚赖氨酸合成酶(pls)合成ε
‑
聚赖氨酸，分泌至细胞外。同时，在白色链霉菌内发现存在ε
‑
聚赖氨酸降解酶(pld)和Ⅱ型ε
‑<br/>聚赖氨酸降解酶(pldⅡ)两种降解酶，对ε
‑
聚赖氨酸有明显的水解作用。
[0004]之前的研究表明，ε
‑
聚赖氨酸降解酶pldII在ε
‑
聚赖氨酸的降解中发挥主要的作用。由于ε
‑
聚赖氨酸降解酶pldII在基因组上的位置紧随ε
‑
聚赖氨酸合成酶(pls)，二者翻译偶联。利用CRISPRi系统对ε
‑
聚赖氨酸降解酶pldII在基因组原位进行转录抑制，探究抑制菌株Streptomyces albulus pldII
‑
TR在ε
‑
聚赖氨酸生产、合成中的应用。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供pldⅡ在提高ε
‑
聚赖氨酸聚合度中的用途和方法，用于解决现有技术中的问题。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供水平或活性被抑制的ε
‑
聚赖氨酸生产菌在提高ε
‑
聚赖氨酸聚合度中的用途。
[0007]本专利技术还提供一种生产高聚合度ε
‑
聚赖氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]1)培养pldⅡ水平或活性被抑制的ε
‑
聚赖氨酸生产菌；
[0009]2)收集发酵液并提取高聚合度ε
‑
聚赖氨酸。
[0010]优选的，步骤1)中pldⅡ水平或活性被抑制的ε
‑
聚赖氨酸生产菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2022940的Streptomyces albulus pldII
‑
TR菌株。
[0011]在本专利技术的某些实施方式中，步骤2)中提取发酵液的步骤如下：
[0012]2a)将发酵液离心收集上清液；
[0013]2b)调节上清液的pH为碱性，过滤除去絮状沉淀；
[0014]2c)将滤液过树脂柱去除杂质，接着洗脱聚赖氨酸，收集洗脱液，并调节洗脱液pH；
[0015]2d)向洗脱液中加入脱色剂脱色，过滤，收集滤液；
[0016]2e)将滤液进行浓缩、烘干，得高聚合度ε
‑
聚赖氨酸。
[0017]优选的，2c)中还包括以下特征中的任一项或多项：
[0018]I、将滤液过D155树脂柱，然后用醋酸冲洗树脂柱，去杂质；优选的，滤液以35～45ml/min的流速过D155树脂柱；优选的，所述D155树脂柱的柱体积为3L；优选的，醋酸的流速为45～55ml/min；
[0019]II、用盐酸冲洗树脂柱以洗脱聚赖氨酸；
[0020]III、调节洗脱液pH至5.5～6.5。
[0021]本专利技术还提供一株白色链霉菌Streptomyces albulus pldII
‑
TR，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022940。
[0022]本专利技术还提供所述白色链霉菌Streptomyces albulus pldII
‑
TR在制备高聚合度ε
‑
聚赖氨酸中的用途。
[0023]如上所述，本专利技术的pldⅡ在提高ε
‑
聚赖氨酸聚合度中的用途和方法，具有以下有益效果：
[0024]1、本专利技术实现了在白色链霉菌内对II型ε
‑
聚赖氨酸降解酶基因pldII的转录抑制，构建了新的基因工程菌Streptomyces albulus pldII
‑
TR。
[0025]2、本专利技术在实验室水平对发酵液中积累的ε
‑
聚赖氨酸进行纯化提取的方法简单、快捷。
[0026]3、本专利技术利用基因工程菌Streptomyces albulus pldII
‑
TR发酵液中提取的ε
‑
聚赖氨酸实现了对芽孢杆菌高效的抑制。
[0027]4、本专利技术在基因工程菌Streptomyces albulus pldII
‑
TR发酵液中提取的ε
‑
聚赖氨酸表现出不同的聚合度分布趋势。
附图说明
[0028]图1为pSET152
‑
dCas9
‑
pldII抑制质粒谱图。
[0029]图2为菌株构建抗性基因PCR验证图。
[0030]图3为基因工程菌pldII
‑
TR与出发菌KCTC 9669生产ε
‑
聚赖氨酸能力比较图。
[0031]图4为基因工程菌pldII
‑
TR与出发菌进行5L发酵罐转化时的菌体量与ε
‑
PL产量的对比图。
[0032]图5为基因工程菌pldII
‑
TR产物ε
‑
聚赖氨酸实物图。
[0033]图6为基因工程菌pldII
‑
TR与出发菌KCTC 9669生产ε
‑
聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌抑菌能力比较图。
[0034]图7
‑
1为出发菌KCTC 9669发酵液提取得到的ε
‑
聚赖氨酸样品MALDI
‑
TOF/TOF质谱分析图。
[0035]图7
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.pldⅡ水平或活性被抑制的ε
‑
聚赖氨酸生产菌在提高ε
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聚赖氨酸聚合度中的用途。2.一种生产高聚合度ε
‑
聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)培养pldⅡ水平或活性被抑制的ε
‑
聚赖氨酸生产菌；2)收集发酵液并提取高聚合度ε
‑
聚赖氨酸。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，pldⅡ水平被抑制选自pldⅡ基因的转录或翻译被抑制。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，pldⅡ基因的转录被抑制为在基因组上原位抑制pldⅡ转录；优选的，利用CRISPRi系统在基因组上原位抑制pldII转录。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述ε
‑
聚赖氨酸生产菌为白色链霉菌。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中pldⅡ水平或活性被抑制的ε
‑
聚赖氨酸生产菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2022940的Streptomyces albulus pldII
‑
TR菌株。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中培养的条件包括以下中的一项或多项：A.培养温度为27～35℃；B.步骤1)中培养的初始pH为6.5～7.5；发酵过程中当pH降低至4时，向培养体系中加入碱维持pH为4；C.步骤1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旸，陈少欣，李沁雨，赵志军，
申请(专利权)人：江苏诺兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：