【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及昆虫生物，更具体的说是涉及一种植物介导的美洲斑潜蝇基因沉默方法及应用。
技术介绍
1、利用农杆菌介导的瞬时表达方法是近年来发展形成的一种在植物中瞬时表达外源基因的快速有效方法，即通过在植物叶片上注射农杆菌菌液，使目的基因转入植物细胞中进行快速表达。与传统的转基因技术相比，农杆菌介导的外源基因瞬时表达法虽然不能稳定遗传，但该方法具有操作简易、周期短、表达效率高、安全高效、成本低等优点。
2、美洲斑潜蝇(liriomyza sativae blanchard)是我国重要的一种检疫蔬菜害虫，寄主范围广，主要危害豆科、十字花科、葫芦科类蔬菜。成虫幼虫均可发生危害，成虫通过产卵或用产卵器刺伤植物叶片后，取食植物的汁液产生危害，幼虫通过潜食在植物叶表皮下发生危害，影响植物的光合作用，造成蔬菜作物减产，品质下降，严重时甚至导致作物绝收，给我国的农业生产造成巨大的经济损失。
3、目前，防治美洲斑潜蝇的主要手段是以化学农药为主，但大量农药的不合理使用，不仅会伤害潜叶蝇的自然天敌，还易使该斑潜蝇产生抗药性，而且污染环境，危害人类的健康。因此，开发一项防治美洲斑潜蝇的新技术已迫在眉睫。
4、rna干扰技术(rna interference，rnai)通过dsrna(double-stranded rna)诱导同源mrna的降解，实现对特异靶标基因的沉默，从而破坏靶标基因的翻译和后续基因功能的发挥。rna干扰具有操作简单、效率高、特异性强的特点。
5、虽然相关rna干扰方法在斑潜蝇其它物种中
6、因此，能否提供美洲斑潜蝇基因沉默的方法及其应用，克服上述技术问题是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种植物介导的美洲斑潜蝇基因沉默方法及应用，具体涉及在蔬菜作物-小青菜(brassica rapa ssp.chinensis)叶片上，通过农杆菌瞬时表达目的基因dsrna，实现美洲斑潜蝇基因沉默方法及应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用技术方案：
3、一种美洲斑潜蝇lsactin基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术还提供了一种植物介导的美洲斑潜蝇基因沉默方法，利用上述lsactin基因cds序列构建植物rnai载体，转化到农杆菌中得到包含靶标位点序列的农杆菌菌液，再注射到植物叶片中，饲喂美洲斑潜蝇成虫。
5、优选的：包括以下步骤：
6、(1)根据美洲斑潜蝇转录组数据选取目的lsactin基因cds序列，并确定目的基因靶标位点序列；
7、(2)构建植物rnai载体，将靶标位点序列构建到植物rnai载体中；
8、(3)农杆菌培养：将植物rnai载体转化到农杆菌中，培养，得到包含靶标位点序列的农杆菌菌液；
9、(4)将得到的包含靶标位点序列的农杆菌注射到植物叶片中，白天/黑夜＝14:10h，温度为26℃；培养1天；
10、(5)剪取农杆菌注射过的植物叶片，制作培养皿，释放美洲斑潜蝇成虫取食叶片，培养带虫培养皿，统计成虫死亡率，检测候选基因的沉默效率。
11、本专利技术还提供了一种抑制上述基因的转录本合成的物质，物质为rnai载体。
12、优选的：rnai靶标位点的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13、本专利技术还提供了一种rnai载体的制备方法，包括：提取美洲斑潜蝇rna，反转录为cdna，以该cdna为模板，选取rnai靶标位点并扩增rnai正向片段、rnai反向片段，利用dna无缝克隆方法获得靶标位点rnai载体；
14、扩增rnai正向片段的引物：
15、98lsactinf，核苷酸序列如seq id no.3所示；
16、99lsactinr，核苷酸序列如seq id no.4所示；
17、扩增rnai反向片段的引物：
18、100lsactinf，核苷酸序列如seq id no.5所示；
19、101lsactinr，核苷酸序列如seq id no.6所示。
20、本专利技术还提供了上述基因，或上述任一方法，或上述任一物质在育种、虫害防治中的应用。
21、优选的：应用作物为小青菜。
22、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种植物介导的美洲斑潜蝇基因沉默方法及应用，取得的技术效果为：
23、首次提供一种高效沉默美洲斑潜蝇基因的方法体系，可用于研究美洲斑潜蝇的功能基因。
24、本专利技术是美洲斑潜蝇的第一种rnai方法，填补了该领域的研究空白。
25、与常规的人工合成dsrna显微注射法相比，操作更简单，青菜处理好，释放美洲斑潜蝇取食即可，对仪器设备要求不高；且rnai沉默效率非常高，24h目的基因(以美洲斑潜蝇lsactin基因为例)沉默效率就可达到90％左右。使用植物材料为常见的蔬菜品种小青菜(brassica rapa spp.chinensis)，非常易于获得和人工栽培。
26、操作简单、成本低廉、周期短、效率高。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种美洲斑潜蝇Lsactin基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种植物介导的美洲斑潜蝇基因沉默方法，其特征在于，利用权利要求1所述Lsactin基因CDS序列构建植物RNAi载体，转化到农杆菌中得到包含靶标位点序列的农杆菌菌液，再注射到植物叶片中，饲喂美洲斑潜蝇成虫。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.一种抑制权利要求1所述基因的转录本合成的物质，其特征在于：所述物质为RNAi载体。
5.如权利要求3所述物质，其特征在于，RNAi靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
6.一种RNAi载体的制备方法，其特征在于，包括：提取美洲斑潜蝇RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，选取RNAi靶标位点并扩增RNAi正向片段、RNAi反向片段，利用DNA无缝克隆方法获得靶标位点RNAi载体；
7.权利要求1所述基因，或权利要求2、3任一所述方法，或权利要求4、5任一所述物质在育种、虫害防治中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，应用
...【技术特征摘要】
1.一种美洲斑潜蝇lsactin基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种植物介导的美洲斑潜蝇基因沉默方法，其特征在于，利用权利要求1所述lsactin基因cds序列构建植物rnai载体，转化到农杆菌中得到包含靶标位点序列的农杆菌菌液，再注射到植物叶片中，饲喂美洲斑潜蝇成虫。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.一种抑制权利要求1所述基因的转录本合成的物质，其特征在于：所述物质为rnai载体。
5.如权...
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