【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法。
技术介绍
1、活体采卵(ovumpick-up，opu)结合体外受精(in vitro fertilization，ivf)技术可反复从良种水牛体内采集卵母细胞，生产大量遗传性状优良的水牛胚胎，如今已发展成为水牛杂交改良的主要技术手段。但由于水牛卵巢上原始卵泡数量低，且对超数排卵药物的反应性差，平均每头次opu得到的卵母细胞数仅为4-6枚，可用卵母细胞数为2-3枚。为了记录和追溯每头供体生产胚胎的系谱遗传信息，每头次opu得到的卵母细胞应单独培养。但由于卵母细胞数量有限，缺乏卵母细胞和胚胎所分泌的营养素因子的互相作用，opu体外胚胎生产效率低下。另一方面，由于活体采卵的抽吸压力大，且卵母细胞要在活采针内移动近1m的距离到达回收管，卵母细胞外层包裹的卵丘细胞数量有限，颗粒细胞的旁分泌作用减弱。如此为了保证opu的胚胎生产效率，一般会将来自不同供体的胚胎混合培养，导致无法追溯胚胎的系谱，阻碍水牛遗传改良。可见，传统的培养方法下opu-ivf胚胎的系谱和胚胎生产效率是矛盾的。因此需要发展出一种提高活体采卵胚胎生产效率的培养系统，保证系谱明确的前提下生产尽量多的良种胚胎用于本地水牛的杂交改良。
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术目的在于提供一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，本专利技术采用的是采集单头牛opu得到的回收液，在捡出卵母细胞之后，利用percoll密度梯度离心分离出颗粒细胞
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，具体包括以下具体步骤：
4、(1)活体采卵(opu)：
5、选取经产的非哺乳期经产水牛，每周进行两次opu，每批次水牛连续活采2个月；
6、(2)颗粒细胞的准备：
7、opu回收液体过滤，离心，收集沉淀；准备percoll离心液；将沉淀用pbs重悬后加入离心管中percoll离心液的上层、离心；取percoll层的细胞用pbs离心洗涤，然后将细胞直接使用或者冷冻保存；
8、(3)卵母细胞体外成熟(ivm)：
9、颗粒细胞用ivm液重悬直接用于同一供体牛opu采得的卵丘-卵母细胞复合体(cocs)共培养，密度约为1×107/ml，与cocs一同转入矿物油覆盖的40μl的ivm液滴中，在5％co2、38.5℃和饱和湿度的条件下培养22～24h；每头牛只的颗粒细胞对应培养该头牛opu-cocs和之后的体外受精(ivf)胚胎；
10、(4)体外受精：
11、冻精解冻并悬浮在洗精液中，取上清，离心洗涤，然后用ivf液重悬，调整精子密度至2×106个/ml左右；成熟的cocs用ivf液洗涤2次，转移到覆盖石蜡油的30μl的ivf微滴中，再向每个ivf微滴中添加10μl的重悬精子，精子与成熟后的cocs在38.5℃、5％co2和饱和湿度条件下共同培养22～24h；
12、(5)胚胎体外培养：
13、受精后将ivf胚胎再次转入之前的ivm微滴中，更换液体为40μl的胚胎培养(cm)液，与颗粒细胞单层在38.5℃、5％co2和饱和湿度条件下共培养；每隔2天半量更换cm液；培养48h后记录卵裂数，培养8d内记录囊胚数。
14、进一步说明，步骤(1)中，所述opu的操作方法是：水牛保定后彻底清洁外阴和会阴区域；通过直肠操作卵巢，将卵巢置于b超探头前，在超声显示屏上获得清晰图像；采用50cm长的17号针头在50mm hg的真空压力下穿刺所有可见卵泡，将卵泡液吸入50ml离心管中30～35℃保温；4次opu结束后，室温20min内将离心管送至实验室；在体视显微镜下捡出cocs，选择细胞质均匀的cocs进行ivm。
15、进一步说明，步骤(2)中，所述颗粒细胞准备的具体方法是：1)opu回收液体经细胞网筛过滤后，2500rpm离心5min收集下层沉淀；2)percoll离心液的准备：用pbs等量倍比稀释percoll，取3ml的pbs加入离心管，而后轻轻覆盖2ml 50％的percoll稀释液；3)将沉淀用pbs重悬后缓缓加入离心管中percoll液体上层，2500rpm离心5min；4)取percoll层的细胞用pbs离心洗涤两次；5)离心洗涤后的细胞直接使用或者冷冻保存。
16、进一步说明，步骤(3)中，所述的颗粒细胞是新鲜细胞直接用于同一供体牛采得的cocs共培养，或是冷冻保存的细胞37℃水浴解冻后加入pbs，2500rpm离心洗涤5min去除冷冻液后使用。
17、进一步说明，步骤(3)中，所述ivm液的配方为tcm199+10％fbs+5μg/mlfsh+10μg/ml lh+0.2mm丙酮酸钠+1μg/ml e2+50μm半胱氨酸+25ng/ml egf。
18、进一步说明，步骤(4)中，所述冻精解冻是在38℃水浴解冻，悬浮在3ml洗精液30min后取上清，2500rpm离心洗涤5min，弃上清后再加入2ml的ivf液2500rpm，离心洗涤5min，200μl的ivf液重悬下层沉淀；所述洗精液配方为改良tyrod's液+0.6％bsa；所述ivf液配方为改良tyrod's液+60μg/mlheparin+0.6％bsa。
19、进一步说明，步骤(5)中，所述胚胎培养液的配方为tcm199+10％fbs。
20、由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
21、本专利技术采用的是采集单头牛opu得到的回收液，在捡出卵母细胞之后，利用percoll密度梯度离心分离出颗粒细胞，直接或经冷冻-解冻后与回收的卵母细胞和胚胎一起共培养，在保证所生产胚胎系谱明确的前提下，提高opu-ivf胚胎的生产效率以及胚胎质量，采用本专利技术的方法可以生产尽量多的良种胚胎用于本地水牛的杂交改良，具有极大的推广价值。
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1.一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述OPU的操作方法是：水牛保定后彻底清洁外阴和会阴区域；通过直肠操作卵巢，将卵巢置于B超探头前，在超声显示屏上获得清晰图像；采用50cm长的17号针头在50mm Hg的真空压力下穿刺所有可见卵泡，将卵泡液吸入50mL离心管中30～35℃保温；4次OPU结束后，室温20min内将离心管送至实验室；在体视显微镜下捡出COCs，选择细胞质均匀的COCs进行IVM。
3.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述颗粒细胞准备的具体方法是：1)OPU回收液体经细胞网筛过滤后，2500rpm离心5min收集下层沉淀；2)Percoll离心液的准备：用PBS等量倍比稀释Percoll，取3mL的PBS加入离心管，而后轻轻覆盖2mL 50％的Percoll稀释液；3)将沉淀用PBS重悬后缓缓加入离心管中Percol
4.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的颗粒细胞是新鲜细胞直接用于同一供体牛采得的COCs共培养，或是冷冻保存的细胞37℃水浴解冻后加入PBS，2500rpm离心洗涤5min去除冷冻液后使用。
5.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述IVM液的配方为TCM199+10％FBS+5μg/mL FSH+10μg/mL LH+0.2mM丙酮酸钠+1μg/mL E2+50μM半胱氨酸+25ng/mL EGF。
6.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述冻精解冻是在38℃水浴解冻，悬浮在3mL洗精液30min后取上清，2500rpm离心洗涤5min，弃上清后再加入2mL的IVF液2500rpm，离心洗涤5min，200μL的IVF液重悬下层沉淀；所述洗精液配方为改良Tyrod's液+0.6％BSA；所述IVF液配方为改良Tyrod's液+60μg/mLheparin+0.6％BSA。
7.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述胚胎培养液的配方为TCM199+10％FBS。
...【技术特征摘要】
1.一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：
2.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述opu的操作方法是：水牛保定后彻底清洁外阴和会阴区域；通过直肠操作卵巢，将卵巢置于b超探头前，在超声显示屏上获得清晰图像；采用50cm长的17号针头在50mm hg的真空压力下穿刺所有可见卵泡，将卵泡液吸入50ml离心管中30～35℃保温；4次opu结束后，室温20min内将离心管送至实验室；在体视显微镜下捡出cocs，选择细胞质均匀的cocs进行ivm。
3.根据权利要求1所述的一种自体细胞共培养提高水牛活体采卵胚胎生产效率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述颗粒细胞准备的具体方法是：1)opu回收液体经细胞网筛过滤后，2500rpm离心5min收集下层沉淀；2)percoll离心液的准备：用pbs等量倍比稀释percoll，取3ml的pbs加入离心管，而后轻轻覆盖2ml 50％的percoll稀释液；3)将沉淀用pbs重悬后缓缓加入离心管中percoll液体上层，2500rpm离心5min；4)取percoll层的细胞用pbs离心洗涤两次；5)离心洗涤后的细胞直接使用或者冷冻保存。
4.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨春艳，郑海英，尚江华，段安琴，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所，
类型：发明
国别省市：
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