本发明专利技术属于免疫学检测技术领域，具体涉及苏丹红Ｉ号的中间修饰物及其制备方法和应用。该方法根据威廉姆森合成法成醚的基本原理，在碱性条件下，将苏丹红Ｉ号中酚羟基变为酚钾盐，然后与含有溴的溴酸乙酯反应成酯，用碱水解酯键，再酸化得含有羧基的中间修饰物。将此中间修饰物以碳二亚胺为偶联剂与载体蛋白偶联从而得到苏丹红Ｉ号的人工抗原。整个方法简单易行，操作简便，人工抗原得率和纯度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学
，具体涉及苏丹红I号的中间修饰物的制备方法及其应用。二
技术介绍
苏丹红I号为亲脂性偶氮化合物，是一种人工合成的染料，其化学名称为l-苯基 偶氮_2-萘酚，分子式为C16H12N20。作为一种常用的红色工业染料，它被广泛用于溶剂的增 色以及纺织品的增光等方面。 苏丹红I号在人体还原酶的作用下在体内生成苯胺和1-氨基_2-萘酚。近些年 来的研究表明苏丹红I号的致毒性与代谢生成的胺类及萘酚类物质密切相关。肝脏是苏 丹红I产生致癌性的主要靶器官，当人体误食或接触含有苏丹红I号的食品后，通过人体皮 肤或消化系统进入体内。 一方面，其代谢产物苯胺可直接作用于肝细胞，引起中毒性肝脏疾 病，同时还有可能诱发肝脏基因变异，增加了人体癌变的几率；另一方面，苯胺进入人体后 的代谢产物可以将与血红蛋白结合的Fe"氧化为Fe、使得血红蛋白无法结合氧从而导致 患上高铁血红蛋白症。苏丹红I号的另一种代谢产物l-氨基-2-萘酚具有致癌、致畸、致 敏、致突变的潜在毒性，对眼、皮肤、粘膜有强烈的剌激作用，大量吸收可能会引起出血性肾 炎。此外，它还可引起膀胱、脾脏等其他器官的肿瘤。 国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)将 苏丹红I号归为三类致癌物，即动物致癌物。1995年欧盟等国家禁止苏丹红作为食品添加 剂，中国也在1996年的《食品添加剂卫生标准》中明令禁止使用苏丹红。但是由于其价廉 易得，色泽鲜亮持久等特点，仍然有一些不法食品生产商、违规加工、违法使用苏丹红染料。 这一方面给国家的食品安全带来了很大的隐患；另一方面，也给消费者的身心健康带来严 重威胁。 目前，国内外对食品中苏丹红I号的常用检测方法是高效液相色谱法(HPLC)、高 效液相-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、化学发光法等。最近，极 谱法、分子印迹技术(MIT)以及表面等离子共振技术(SPR)都被应用在苏丹红I号的测定 中。 尽管目前有很多种方法和手段可以检测苏丹红I号，而且检测效果都还不错。但 是，这些方法的样品前处理比较复杂繁琐，需要精密昂贵的仪器设备，同时还要有专门的仪 器操作人员等，很难达到快速、简便的现场检测要求，因此限制了其在基层检测部门的大规 模推广使用。 酶联免疫检测分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)由于具有特异 性强、灵敏度高、简便、快速等优点，近年来备受人们的关注。免疫分析是以抗体作为生物检 测器的分析技术，而苏丹红I号作为小分子物质，分子量为248，是半抗原，本身不具有诱导 产生抗体的能力，不能直接通过它免疫动物而得到检测所必须的抗体，因此，合成苏丹红I 号的人工抗原便成为建立其ELISA分析方法的首要步骤和关键所在。 苏丹红I号分子结构本身没有可以直接和载体蛋白偶联的氨基或羧基，因此需要 引入。本专利技术根据威廉姆森合成法成醚的基本原理，在碱性条件下，将苏丹红I号中酚羟基 变为酚钾盐，然后与含有溴的溴酸乙酯反应成酯，用碱水解酯键，后酸化得含有羧基的中间 修饰物，将此中间修饰物以碳二亚胺为偶联剂与载体蛋白偶联从而得到苏丹红I号的人工 抗原。 本专利技术所描述的合成方法，国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是 本专利技术主要是利用新的合成路线，为苏丹红I号提供了一种全新的人工抗原的制备方法。 本专利技术的技术方案是 本专利技术所述苏丹红I号的中间修饰物的结构如图1所示，其中n = 3，4，5。 由于苏丹红I号分子结构本身没有可以直接和载体蛋白偶联的氨基或羧基，因此 需要引入。本专利技术根据威廉姆森合成法成醚的基本原理，在碱性条件下，将苏丹红I号中酚 羟基变为酚钾盐，然后与含有溴的溴酸乙酯反应成酯，用碱水解酯键，后酸化得含有羧基的 中间修饰物，将此中间修饰物以碳二亚胺为偶联剂与载体蛋白偶联从而得到苏丹红I号的 人工抗原。 苏丹红I号中间修饰物的合成 (1)将苏丹红I号(20mmol，4. 96g) 、6-溴己酸乙酉旨(40mmol， 7. 2ml)、 K2C03(140mmol，19. 32g)按1 : 2 : 7的摩尔比溶解于无水丙酮(Acetone)中，搅拌加热回 流2天，薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)鉴定苏丹红I号是否反应完全。TLC条件石油醚乙酸乙酯(V/V) = 1 : 50 ; (2)反应液抽滤以除去未反应的1(20)3，然后旋蒸以除去丙酮； (3)过柱先用完全石油醚洗脱，将最下面浅黄色层完全洗出，旋蒸，鉴定其为未反应完的六溴己酸乙酯；接着用石油醚乙酸乙酯=30 : i的洗脱液洗柱，将深红色的部分洗出，得产物； (4)产物用乙醇完全溶解后，加入过量的30% NaOH，搅拌过夜使其充分水解； (5)将水解液中的乙醇旋蒸除去，后加入10%稀盐酸酸化，调pH < 7. O，溶液呈酸 性，此时有沉淀析出，抽滤，沉淀水洗5次，得苏丹红I号的中间修饰物。 苏丹红I号与蛋白偶联物的合成 (1)将苏丹红I号的中间修饰物(72. 4mg， 200uM) 、 二环己基碳二亚胺 (N， N ' -dicyclohexylcarbodiimide， DCC，41. 2mg，200uM) 、 N-羟基琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysuccinimide， NHS， 23mg， 200uM)按等摩尔比混合，溶解于400ul无水N， N- 二甲 基甲酰胺(N， N-dimethylformamide， DMF)中，室温搅拌过夜； (2)将混合液缓慢逐滴加入到4ml冰浴的167. 5mg/ml的BSA溶液中，fC搅拌反应 过夜； (3)将反应液转移至透析袋中，以PBS为透析液4t:透析4天，每12小时换一次透 析液，以除去未反应的杂质； (4)透析结束后，将反应液离心，7000rpm，5min ;得苏丹红I号的人工抗原，其结构 如图2所示。 苏丹红I号人工抗原的合成路线见图3。 本专利技术与已有技术相比其有益效果是 目前所报道的苏丹红I号人工抗原的制备方法中，其中间修饰产物主要是通过丁 二酸酐法直接在酚羟基上引入羧基，连接臂很短，在和载体蛋白相偶联时容易被载体蛋白 包裹，抗原在其表面的展示能力大幅度下降。本专利技术的优势在于提供了一种4-6个碳长度 的连接臂，可以将苏丹红I号的整个结构充分展示在载体蛋白的表面，避免了被载体蛋白 包被在其结构内部的情况，因此大大增强了苏丹红I号被免疫细胞识别的机会，有助于提 高抗体的质量。四附图说明 图1苏丹红I号的中间修饰物结构图 图2苏丹红I号与蛋白偶联物结构图 图3苏丹红I号人工抗原的合成路线图 图4苏丹红I号中间修饰物的核磁共振图 图5苏丹红I号与载体蛋白偶联物的紫外扫描图谱五具体实施例方式实施例1苏丹红I号-一BSA偶联物 (1)将苏丹红I号4. 96g，6-溴己酸乙酯7. 2ml，K2C03 19. 32g按l : 2 : 7的摩尔 比溶解于无水丙酮中，搅拌加热回流2天，薄层色谱(TLC)鉴定苏丹红I号是否反应完全。 TLC条件石油醚乙酸乙酯(v/v) = 1 : 50 ;本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苏丹红Ⅰ号的中间修饰物，其特征在于结构为： ＊＊＊ 其中，ｎ＝３，４，５，在被修饰的酚羟基部位引入了４－６个碳长度的连接臂，当其与载体蛋白偶联时，可以将苏丹红Ⅰ号的整个结构充分展示在载体蛋白的表面。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈萍萍，徐加发，成义祥，黄小波，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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