本公开提供适用于核酸聚合的组合物、方法、套组、系统以及设备。确切地说，提供允许核酸扩增的重组聚合酶和其生物活性片段。在一些方面中，本公开提供当在合成测序反应中使用时相比于对照聚合酶产生较低系统误差速率和/或改进的准确度的重组聚合酶。在一个方面中，本公开涉及适用于核酸测序、基因分型、拷贝数变异分析、双端测序和基因分析的其它形式的重组聚合酶。在另一个方面中，所述重组聚合酶适用于在PCR、emPCR、等温扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、链置换扩增和邻位连接扩增期间扩增核酸模板。在一些方面中，本公开涉及适用于产生核酸库和/或核酸模板的重组聚合酶。生核酸库和/或核酸模板的重组聚合酶。生核酸库和/或核酸模板的重组聚合酶。
【技术实现步骤摘要】
聚合酶组合物和套组以及其使用与制造方法
[0001]本申请是申请日为2016年9月27日、专利技术名称为“聚合酶组合物和套组以及其使用与制造方法”的中国专利技术专利申请No.201680064448.7的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2015年10月1日申请的美国临时申请第62/235,616号的权益。本申请以全文引用的方式并入本文中。
[0004]序列表
[0005]本申请在此以引用的方式并有与此同时提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料以标题为“LT01102PCT_SeqList_092316.txt”、创建于16年9月23日的文件大小为698KB的文本(.txt)文档形式提交，且以全文引用的方式并入本文中。
[0006]经修饰的DNA聚合酶和组合物和套组，以及其使用和制造方法。
技术介绍
[0007]酶催化生物反应的能力对生命来说是基本的。一系列生物应用使用酶来活体外合成各种生物分子。一种尤其适用的类别的酶为聚合酶，其可催化生物分子(例如核苷酸或氨基酸)聚合成生物聚合物(例如核酸或肽)。举例来说，尤其以模板依赖性方式可将核苷酸聚合成核酸的聚合酶适用于重组DNA技术和核酸测序应用中。许多核酸测序方法在由聚合酶催化的活体外模板依赖性核酸合成期间监测核苷酸掺入。单分子测序(SMS)和双端测序(PES)典型地包括用于模板依赖性核酸合成的聚合酶。聚合酶也适用于产生核酸库，如在乳液PCR或桥式PCR期间产生的文库。使用此类聚合酶产生的核酸库可用于多种下游工艺中，如基因分型；核苷酸多态性(SNP)分析；拷贝数变异分析；表观遗传分析；基因表达分析；杂交阵列；基因突变分析，包括(但不限于)疾病病况的检测、预后和/或诊断；罕见或低频等位基因突变的检测和分析；以及核酸测序，包括(但不限于)从头测序或目标重测序。
[0008]当进行聚合酶依赖性核酸合成或扩增时，其可适用于修饰聚合酶(例如经由突变或化学修饰)以改变其催化特性。在一些情况下，其可适用于修饰聚合酶以增强其催化特性。在一些实施例中，其可适用于经由定点氨基酸取代或缺失增强聚合酶的催化特性。可通过聚合酶对核苷酸底物的动力学行为来限制涉及核酸合成的各种生物分析中的聚合酶性能。举例来说，聚合酶活性分析可因以下非所需行为而变得复杂：如给定聚合酶从模板解离；结合和/或并入不正确(例如非沃森
‑
克里克(Watson
‑
Crick)碱基配对)的核苷酸；或释放正确(例如沃森
‑
克里克碱基配对)的核苷酸而非并入的倾向。这些和其它所需特性可经由所选聚合酶的适合的选择、工程改造和/或修饰来增强。举例来说，可进行此类修饰以有利地改变聚合酶的核苷酸掺入比率、结合到模板的亲和力、持续合成能力、平均阅读长度、核苷酸掺入准确度、链偏差、系统误差和/或总测序通量；此类改变可提高序列信息量和/或获自单一测序反应的测序信息的质量。在所属领域中仍需要展现改变的特性，例如提高的持续合成能力、增加的阅读长度(包括无误差阅读长度)、提高的原始准确度和/或对DNA模
板的亲和力、增加的测序通量、减少的链偏差和/或减少的系统误差的改进的聚合酶组合物。此类聚合酶组合物可适用于广泛多种涉及聚合酶依赖性核酸合成的分析，包括核酸测序、qPCR、PCR、桥式PCR、等温扩增、克隆扩增以及核酸库产生。
技术实现思路
[0009]本专利技术大体上涉及非天然存在的突变(典型地重组)Bst聚合酶和组合物、套组和其使用和制造方法。相比于参考(例如野生型)Bst聚合酶，突变(例如重组)Bst聚合酶含有至少一种氨基酸突变(例如取代、缺失或添加)且具有改良的特性。在一些实施例中，相比于野生型和/或参考突变Bst DNA聚合酶，突变(例如重组)Bst DNA聚合酶在合成测序反应，尤其在其中产生和/或检测氢离子的步骤中使用突变Bst聚合酶的合成测序反应中具有减少的系统误差、提高的信噪比和/或改进的准确度。此外，本文提供用于进行聚合反应的方法，其包括在一种或多种核苷酸存在下使本文所提供的突变(例如重组)Bst DNA聚合酶或其生物活性片段与核酸模板接触，且使用突变聚合酶或其生物活性片段使一种或多种核苷酸中的至少一种聚合。
[0010]因此，在说明性实施例中，本专利技术提供典型地为重组DNA聚合酶的非天然存在的突变DNA聚合酶以及包括突变(例如重组)DNA聚合酶的组合物、套组和方法，其中聚合酶具有与SEQ ID NO:1或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的多肽链段，展现聚合酶活性，且包括(a)一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：E30K、G209Q、E220H或E220T、N234K、P236I或P236R、E245R、L252R、S260K、D264K或D264M、E267M或E267K或E267R、E277T、T324R、E325R、A344Y、E442R或E442Y、E456R、H473G、D480L、N485R、A492K、E493G或E493R、M495C、N517C或N517K、E522C和H528T；或(b)两个或更多个选自以下的氨基酸取代：E30K、G209Q、E220H、E220K或E220T、N234K或N234R、P236I或P236R、V241K、E245R、V251R、L252R、S260K、D264K或D264M、E267M或E267K或E267R、E277T、E294K、T324R、E325R、A344Y、E442R或E442Y、E456R、H473G、D480L或D480R、N485R、A492K、E493G或E493R、M495C、N517C或N517K、E522C和H528T。相比于使用参考Bst聚合酶，如野生型Bst聚合酶、SEQ ID NO:2的突变Bst聚合酶或SEQ ID NO:35的突变Bst聚合酶获得的误差率、准确度和/或信噪比，当在其中释放和/或检测氢离子的合成测序反应中使用时，突变(例如重组)DNA聚合酶可导致降低的误差率(例如平均系统误差率)、改进的准确度和/或提高的信噪比。聚合酶在说明性实例中具有改进的特性的合成测序反应为释放和检测氢离子的测序反应。说明性实施例中的突变(例如重组)聚合酶包括氨基酸取代H46R、E446Q和H572R，和/或可包括突变H281M、D423K和N487R，其中编号相对于SEQ ID NO:1。在说明性实施例中，突变(例如重组)聚合酶不具有5'到3'核酸外切酶活性和/或3'到5'核酸外切酶活性。在说明性实施例中，突变(例如重组)聚合酶不包含具有3'到5'核酸外切酶活性和/或5'到3'核酸外切酶活性的野生型Bst DNA聚合酶的链段。
[0011]说明性实施例中的突变(例如重组)DNA聚合酶包括L252R、H473G和H528T中的一种或多种，其中编号相对于SEQ ID NO:1。因此，在本文所提供的某些实例中，突变(例如重组)DNA聚合酶与SEQ ID NO:1或其片段具有至少80％、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种包含重组DNA聚合酶的组合物，其中所述DNA聚合酶表现出聚合酶活性，并且是相对于SEQ ID NO:35而言包含取代的突变聚合酶，其包括：(a)选自V241K、N234K或N234R、E220K、E294K、D480R和V251R的单个氨基酸取代，其中所述编号是相对于SEQ ID NO:35的；或(b)L252R和H528T的两个氨基酸取代，其中所述编号是相对于SEQ ID NO:35的。2.根据权利要求1所述的组合物，其中与使用SEQ ID NO:35获得的误差率相比，所述重组DNA聚合酶在用于其中检测出氢离子的合成测序反应中时，产生更低的误差率、提高的准确性和/或增加的信号。3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述重组DNA聚合酶包括L252R和H528T，其中所述编号是相对于SEQ ID NO:35的。4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述重组DNA聚合酶具有SEQ ID NO:118的序列。5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述重组DNA聚合酶不包含具有3'至5'核酸外切酶活性和/或5'至3'核酸外切酶活性的野生型Bst DNA聚合酶的区段。6.一种用于进行聚合反应的方法，包括：(a)在一种或多种核苷酸的存在下，使权利要求1所述的重组DNA聚合酶与核酸模板接触，以及(b)使用所述重组DNA聚合酶聚合所述一种或多种核苷酸中的至少一种。7.根据权利要求6所述的方法，其中在一种或多种核苷酸和盐的存在下使所述重组DNA聚合酶与所述核酸模板接触，其中所述盐是KCl和/或NaCl。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述盐浓度为125mM至175mM。9.根据权利要求6所述的方法，其中使用所述重组DNA聚合酶对所述一种或多种核苷酸中的至少一种进行聚合是在用于扩增所述核酸模板的合适条件下进行的，其中所述核酸模板被扩增。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述重组DNA聚合酶在一种或多种核苷酸和盐的存在下与所述核酸模板接触，其中所述盐是KCl和/或NaCl。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述盐浓度为125mM至175mM。12.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：
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