利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法技术

本发明专利技术涉及突变体的筛选方法技术领域，尤其为利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法，首先对Taq酶原始序列的确定，根据氨基酸序列进行基因合成，将目的片段构建入pET30a载体中，接着采用易错PCR对目的基因的核苷酸进行突变，并构建突变体表达文库，采用易错PCR对目的基因的核苷酸进行突变，取突变体库菌种1ml转接入50ml的LB培养基中，37℃在摇床上进行160rpm振荡培养，待菌液OD600达到0.5左右时，降温至30℃，本发明专利技术不需要进行荧光探针法检测，只需要采用常规的PCR条件即可，对设备要求低，较易实现，同时，此发明专利技术在筛选时不需要靶向到特定的单细胞，主要通过优势积累，只对最终的产物进行提取分析，即可获得目的基因或目的突变文库。的基因或目的突变文库。

【技术实现步骤摘要】
利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法


[0001]本专利技术涉及突变体的筛选方法
，具体为利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法。

技术介绍

[0002]自然进化是一个缓慢的过程，依赖于基因突变的逐渐积累，近年来，科学家们找到了在小范围内加快这一过程的方法，使他们能够在实验室里快速制造新的蛋白质和其他分子，往往从无到有地凭空创造一个具备某种特定性能的蛋白分子是比较困难的，最常见的方法是在有较理想原料(亲本)的基础之上进行突变，以获得快速进化，其中最常用的是无性进化和有性进化。无性进化主要通过易错PCR，定点突变和饱和突变等方法，有性进化是指通过基因改组技术对不同来源的基因进行组合，这样可以在短时间内完成自然界需要成千上万年才能发生的突变，产生的大量突变基因中只包括少量的目的突变，要在如此大量的突变中找到目的突变基因是一个较有挑战性的工作。
[0003]目前对于突变体的筛选方式根据突变的性能要求各有不同，可以通过施加筛选压力、表现的性状或蛋白的生物活性(酶活)等条件来进行重组子的确认，一般情况采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：Taq酶原始序列的确定，根据氨基酸序列进行基因合成，将目的片段构建入pET30a载体中；步骤二：采用易错PCR对目的基因的核苷酸进行突变，并构建突变体表达文库将构建的基因进行易错PCR进行随机突变，提取质粒DNA并溶解于水中至浓度为50
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100ng/ul作为扩增模板，取16个PCR管进行扩增，通过梯度稀释扩增，提取扩增产物，经过同源重组技术将目的基因克隆至表达载体中转化入大肠杆菌表达宿主中，构建突变体文库；步骤三：突变体库的诱导表达取突变体库菌种1ml转接入50ml的LB培养基中，37℃在摇床上进行160rpm振荡培养，待菌液OD600达到0.5左右时，降温至30℃，加入无菌过滤的IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达3h，离心收集菌体，用漂洗液对菌体进行重悬漂洗，离心，重复3次后离心收菌冷藏保存，即刻进行接下来的实验，以保证菌体的新鲜；步骤四：猪血扩增体系配制及微液滴制备将上步中收集的菌体进行稀释，稀释至OD600为1OD时，继续稀释1000倍，此时进行微液滴包埋，最终保证每个微液滴中至多只含有1个细胞；步骤五：提取扩增产物将扩增产物用济凡生物的高通量核酸提取设备进行提取，采用磁珠法提取扩增产物并电泳检测。结果显示，其中有两个微孔中出现了扩增条带；步骤六：基因测序获得目的基因将PCR扩增产物送交爱赛生物进行测序，其中一个样本经...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯建敏，韩典霖，杨亮，
申请(专利权)人：济凡生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：