一种可以用于血液检测的PCR反应液及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于血液直接扩增的PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶、缓冲体系、二价阳离子、一价阳离子、dNTPs、PCR反应增强剂和PCR体系稳定剂；所述的Taq DNA聚合酶是抗体修饰的热启动DNA聚合酶、Taq DNA Polymerase中的一种或者两种混合。本发明专利技术提供的PCR反应液可以以全血为模板进行扩增，也可以在血液存在的情况下，扩增其它靶基因，最高可以耐受40%血液。液。液。

【技术实现步骤摘要】
一种可以用于血液检测的PCR反应液及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体一种可以血液为模板直接进行PCR检测的反应液及其试剂盒。
[0002]
技术介绍

[0003]聚合酶链反应(PCR)是一种敏感的DNA扩增程序，可以从复杂混合物中检测特定的核酸。反应体系中包含核酸模板，特异性引物、DNA聚合酶及相应的缓冲体系及离子。在核酸扩增过程中，目的基因、引物和聚合酶混合物在不同的温度下经受连续热循环过程（25～35），扩增新的互补目标序列。自20世纪80年代中期以来，PCR已成为检测微量核酸的标准。
[0004]对于临床诊断和法医检测来说，样本中的抑制物是造成PCR反应中假阴性和低灵敏度的主要问题。
[0005]做为临床上非常重要的血液样本PCR的分析，与人类健康相关的遗传疾病诊断测试中最大的一部分疾病、病毒和微生物感染、血型和安全血库有非常大的相关性。
[0006]血液对PCR的抑制作用尚未明确，部分研究表明抑制扩增的主要原因是DNA聚合酶的失活和/或者捕获或降解目标DNA和原分子。人血液中PCR的几种主要抑制剂如血红蛋白、免疫球蛋白G和乳铁蛋白另外血液蛋白酶活性也可能导致PCR效率的降低(5,9
–
12)。外源性的抗凝剂包括EDTA、肝素等，对PCR扩增也有一定的抑制作用。
[0007]除了上述物质可以抑制PCR反应外，在全血样本的特异性检测中，通常会有其它的非特异扩增，与靶基因共同竞争导致目的基因产物不纯或者无法扩增。
[0008]为了降低血液成分对PCR的抑制作用，人们开发了多种DNA提取方法。这些预处理步骤通常是耗时、劳动密集型和样本特异性的。此外，即使在提取DNA时使用试剂盒，一些PCR抑制剂可能仍然无法完全消除。例如，乙肝病毒检测使用血液DNA纯化试剂盒约有14%的人可能是假阴性。
[0009]目前广泛使用的DNA聚合酶，如Taq DNA Polymerase和热启动型Taq Gold，都可以使用低于0.2%的浓度全血进行PCR扩增。一些非Taq DNA聚合酶，如rTth，Tfl，HotTub和Pwo，能耐受较高浓度的血液。部分Taq突变体，如KT10，T36等可以耐受10
‑
20%血液。通过研究发现一些试剂加入体系后会降低血液对Taq酶的抑制，使Taq酶可以在含2%血液体系中进行扩增，但是这种效果同样具有样本特异性。这些试剂包括，甜菜碱、单链结合蛋白、或者某些蛋白的混合物。

技术实现思路

[0010]本专利技术的一个目的是提供一种全新的可用于血液直扩的PCR反应液（Mix2），其最高可以耐受40%血液。本试剂的专利技术将有利于利用PCR技术对全血样本进行分析检测并克服现有PCR技术存在的上述缺点。
[0011]本专利技术所提供的PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶、缓冲体系、二价阳离子、一价阳
离子、dNTPs、PCR反应增强剂和PCR体系稳定剂。
[0012]其中，所述的TaqDNA聚合酶是抗体修饰的热启动DNA聚合酶、TaqDNAPolymerase中的一种或者两种混合。
[0013]进一步的，所述抗体修饰的热启动DNA聚合酶可选自济凡生物科技（北京）有限公司出售的下述至少一种：A110、A112和A113。
[0014]所述A110：GenFQIIHotStartTaqDNAPolymerase（商品目录号为A110
‑
01或A110
‑
02）；所述A112：GenFQHotStartTaqDNAPolymerase（商品目录号为A112
‑
1或A112
‑
2）；所述A113：GenFQIIIHotStartTaqDNAPolymerase（商品目录号为A113
‑
1或A113
‑
2）。
[0015]所述TaqDNA聚合酶可为济凡生物科技（北京）有限公司的产品GenFQTaqDNAPolymerase，商品目录号为A111
‑
01或A111
‑
02。
[0016]根据本专利技术的一个实施例，所述的TaqDNA聚合酶可为A110或A111或A113或，A112和A110的混合物(酶活比1:1)，或A110和A113的混合物(酶活比1:1)。
[0017]所述的缓冲体系可以是Tris
‑
HCl缓冲液。
[0018]所述的二价阳离子可以是Mg
2+
、Mn
2+
中的一种或者两种混合。具体的，所述Mg
2+
可由MgCl2提供；所述Mn
2+
可由MnCl2提供。
[0019]所述的一价阳离子可以是K
+
、NH4
+
、Na
+
、Li
+
中的一种或者几种混合。
[0020]所述的dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP；具体的，所述dNTPs中，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩尔比可为0.3mM：0.3mM：0.3mM：0.3mM。
[0021]所述的PCR反应增强剂可以是甜菜碱、海藻糖、二甲亚砜（DMSO）、明胶、甘油、SSB（单链结合蛋白）、sso7d蛋白、牛血清白蛋白(BSA)中的一种或者几种混合。
[0022]10
×
所述PCR反应增强剂，包括下述终浓度的物质：甜菜碱1～5M、DMSO0.5～4%（v/v%）、明胶0.05～1%（w/w%）、ETSSB（极高热稳定性单链DNA结合蛋白）0.01～1%（w/w%），溶剂为水。
[0023]根据本专利技术的一个实施例，所述10
×
PCR反应增强剂，包括下述终浓度的物质：甜菜碱3M、DMSO3%（v/v%）、明胶0.5%（w/w%）、ETSSB0.5%（w/w%）。
[0024]所述的PCR体系稳定剂可以是PEG2000、PEG6000、Tween20、NP40、TritonX
‑
100、山梨醇中的一种或几种。
[0025]进一步的，2
×
PCR反应液，包括下述浓度的物质：TaqDNA聚合酶0.02
‑
0.2U/ul、Tris
‑
HCl（pH8.3
‑
9.0）60～400mM、dNTPs0.2～2mM、MgCl24～20mM、KCl20～200M、(NH4)2SO410～80mM、10
×
PCR反应增强剂2%～20%（v/v%）和PCR体系稳定剂0.01%～5%（w/w%）。
[0026]本专利技术中所述2
×
PCR反应液中的溶剂为水，更进一步可为双蒸水（ddH2O）。
[0027]根据本专利技术的一个实施例，所述2
×
PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于血液直接扩增的PCR反应液，包括TaqDNA聚合酶、缓冲体系、二价阳离子、一价阳离子、dNTPs、PCR反应增强剂和PCR体系稳定剂；2
×
所述PCR反应液，包括下述终浓度的物质：Tris
‑
HCl缓冲液300mM、(NH4)2SO420mM、MgCl26mM、Tween20溶液（10%）0.01%（v/v%）、dNTPs0.6mM、KCl100mM、10
×
PCR反应增强剂20%（v/v%）、A112和A1100.1U/μl，溶剂为ddH2O；其中，Tris
‑
HCl的pH值为8.5，所述A112和A110的酶活比为1:1；所述的dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP；其中，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩尔比为1：1：1：1；所述的10
×
PCR反应增强剂，由下述终浓度的物质组成：甜菜碱3M、DMSO3%（v/v%）、明胶0.5%（w/w%）、ETSSB0.5%（w/w%），溶剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟新涛，刘婉君，韩典霖，杨亮，
申请(专利权)人：济凡生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：