一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用技术方案

本发明专利技术涉及一种多重核酸检测系统，其包括针对目标核酸序列的扩增引物组和检测探针组，该检测系统包括采用LNA修饰的Target探针和通过1～8个连续的G碱基达到荧光淬灭效果的Beacon探针，同时基于上述多重核酸检测系统的提出，发明专利技术人结合降落PCR程序，还提出了一种多重核酸检测方法，该方法能够进一步地减少PCR反应中非特异性扩增，提高检测灵敏度。从而克服传统实时荧光定量PCR分型局限性，通过特殊信号和熔解曲线分析实现单管多重分型，实现以更简便的反应体系、更低的检测成本来对样品中的至多20种待测目标核酸序列中的每一个靶基因，均可实现准确定性检测。均可实现准确定性检测。

【技术实现步骤摘要】
一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]实时荧光定量PCR方法是一种分子生物学中常用的核酸检测方法，与普通PCR方法相比，其操作简便，应用广泛。对待测样本的靶基因进行PCR扩增过程中，通过仪器实时监测反应体系产生的荧光信号，对PCR进程进行实时检测。普通PCR扩增技术需要在完成扩增之后，对产物进行电泳分析，分析过程繁琐费时，同时PCR产物的开盖可能导致实验室环境的污染。
[0003]实现荧光信号的方法主要分为探针法和染料法两类，探针法法通过在反应体系中添加荧光基团标记的寡核苷酸探针，实时监测探针释放的荧光信号，实现对靶序列的特异性检测；染料法则是添加双链DNA荧光染料在反应体系中，通过荧光染料结合到DNA双链小沟中，实现对靶序列的检测；
[0004]在实时荧光PCR检测模式中，PCR扩增和靶序列的检测同时进行，无需额外的步骤。因此，实时检测模式简便直接。但是，这种模式在单管检测中能检测的最大靶序列的数目受限于实时PCR仪器的荧光检测通道的数目，一般不超过6个。因此，基于简便直接的方法学优势，需要对实时荧光定量PCR法进行改进，以期实现单管检测中检测更多的靶基因数目。
[0005]US 2013/0109588 A1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时荧光PCR测定方法，通过设计两条探针(PTO探针和CTO探针)来实现对靶序列的检测。当将该专利申请中描述的方法用于实施区分每个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列需要分别设计一条PTO探针和一条CTO探针，即使用双倍数目的探针。例如，该专利申请描述了同时检测奈瑟氏淋球菌和金黄色葡萄球菌的双重实时PCR，其中即使用了2条PTO探针和2条CTO探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单条荧光探针的传统多重PCR相比，该专利的方法更复杂，并且成本昂贵。
[0006]US 2015/0072887 A1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时PCR测定，其通过3条探针来实现对靶序列的实时检测。然而，当将该专利申请描述的方法用于实施需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列需要分别设计3条探针，这导致反应体系中更加复杂，并且检测成本高昂。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种更为便捷高效的多重核酸检测系统。
[0008]包括如下技术方案：
[0009]一种多重核酸检测系统，其特征在于，包括针对目标核酸序列的扩增引物组和检测探针组，所述检测探针组包括Target探针和Beacon探针，所述Target探针从5
′
端到3
′
端的组成依次为：5
′
端区、Target区、3
′
端区；所述Beacon探针从5
′
端到3
′
端的组成依次为：5
′
端区、loop区、3
′
端区；所述Target探针的5
′
端区序列的5
′
端修饰LNA，所述3
′
端区序列的3
′
端修饰C3，所述Target区序列可与目标核酸序列反向互补；所述Beacon探针的5
′
端区序列的5
′
末端为n个连续的鸟嘌呤，n为1
‑
8的整数，所述3
′
端区序列的3
′
末端修饰荧光报告基团，所述3
′
端区序列与5
′
端区序列反向互补。
[0010]本专利技术的目的之一还在于提供一种多重核酸检测方法。
[0011]包括如下技术方案：
[0012]获取待测生物样本核酸；
[0013]将上述生物样本核酸、DNA聚合酶与上述多重核酸检测系统混合配制成PCR反应体系，进行PCR反应和熔解曲线分析。
[0014]本专利技术的专利技术人基于对基因检测技术的深入研究，开发了更为便捷高效的多重核酸检测系统，该检测系统包括Target探针和Beacon探针的双探针体系，专利技术人通过实验发现，通过对Target探针和Beacon探针的结构改造，特别是将Target探针中的5
′
端区和3端区设计为非同源序列，不与模板相结合，且5
′
端区修饰LNA，提高Target探针的Tm值，3
′
端区提供CGCG碱基链，再修饰C3封闭，阻碍非特异性延伸；中间Target区可与目标核酸序列反向互补，从而有效提供结合序列锚定点。同时，Target探针的5
′
端区序列与Beacon探针的loop区反向互补，Beacon探针在游离状态下自然卷曲，因报告基团(R)与5端连续的多个(1～8个)G碱基距离近而无荧光(自淬灭分子信标探针)，在进行目的核酸检测时，Target探针在DNA聚合酶的5
′→3′
外切酶活性作用下，5
′
端区被切离处于游离状态，在低于Tm值的温度时，可以与Beacon探针的loop区杂交结合，又在DNA聚合酶的5
′→3′
聚合酶活性作用下，进行延伸，扩增为双链后，Beacon探针因报告基团与多个G(1～8个)碱基距离远而发荧光。从而在有效降低探针合成成本和检测反应中的非特异性扩增的同时，提高检测灵敏度、特异性和稳定性。
[0015]并且，该检测系统通过CLO引物和通用引物的组合使用，消除了由于特异性引物之间扩增效率的差异，导致的扩增产物中不同扩增子的差异。从而在整体上更稳定地实现样本检测。
[0016]同时基于上述多重核酸检测系统的提出，专利技术人结合PCR程序的设计，通过设计PCR程序，结合降落PCR程序的使用，还提出了一种多重核酸检测方法，该方法能够进一步地减少PCR反应中非特异性扩增，提高检测灵敏度。从而克服传统实时荧光定量PCR分型局限性，通过特殊信号和熔解曲线分析实现单管多重分型，实现以更简便的反应体系、更低的检测成本，在实时荧光定量PCR仪中来对待测样品中的至多20种待测目标核酸序列中的每一个靶基因，均可实现准确定性检测，通过对熔解曲线中的特异性熔解峰进行判读，更能够保证检测的特异性。
附图说明
[0017]图1为本专利技术多重核酸检测系统中各组份的设计原理图。
[0018]图2为实施例2中采用不同引物探针组合对甲型流感病毒进行检测的结果对比图。
[0019]图3为实施例2中采用不同PCR程序扩增得到的甲型流感病毒PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0020]图4为实施例2中采用不同Target探针对甲型流感病毒进行检测的结果对比图。
[0021]图5为实施例2中采用不同Beacon探针对甲型流感病毒进行检测的结果对比图。
[0022]图6为实施例3中采用呼吸道病原体分型检测试剂盒对阳性质控品检测的部分结果，其中，A为FAM通道本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重核酸检测系统，其特征在于，包括针对目标核酸序列的扩增引物组和检测探针组，所述检测探针组包括Target探针和Beacon探针，所述Target探针从5
′
端到3
′
端的组成依次为：5
′
端区、Target区、3
′
端区；所述Beacon探针从5
′
端到3
′
端的组成依次为：5
′
端区、loop区、3
′
端区；所述Target探针5
′
端区序列的5
′
端修饰LNA，所述3
′
端区序列的3
′
端修饰C3，所述Target区序列可与目标核酸序列反向互补；所述Beacon探针5
′
端区序列的5
′
末端为n个连续的鸟嘌呤，n为1
‑
8的整数，所述3
′
端区序列的3
′
末端修饰荧光报告基团，所述loop区序列与5
′
端区序列反向互补。2.根据权利要求1所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述Target探针的3
′
端区序列的3
′
端为CGCG。3.根据权利要求1所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述Beacon探针的5
′
端区序列长度为5～8bp，所述3
′
端区序列长度为5～8bp，和/或所述loop区序列长度为30～50bp。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述Beacon探针的5
″
端区序列的5
′
末端连续的鸟嘌呤个数n为3～5的整数。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述多重核酸检测系统，其特征在于，所述扩增引物组包括CLO引物对，所述CLO引物对中的每一条CLO引物从5
′
端到3
′

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书二四页序列表一零页附图六页，
申请(专利权)人：广州市金圻睿生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：