PCR检测中的消化探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及PCR检测中的消化探针及其试剂盒。消化探针，其结构为：探针5

【技术实现步骤摘要】
PCR检测中的消化探针及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学领域中的临床分子诊断检测技术。本专利技术涉及PCR检测中的消化探针及试剂盒，特别是微卫星不稳定状态检测中野生型目标片断消化探针及其应用，可以提高微卫星不稳定(MSI)检测灵敏度，特别是可以应用于液体活检的MSI检测方法。

技术介绍

[0002]微卫星序列是指核心序列为1～6个碱基的短串联重复结构，这些重复序列分布在整个人类基因组中。在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象被称之为微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)。
[0003]微卫星不稳定(MSI)现象在很多实体瘤中都存在。MSI发生率最高的肿瘤类型包括子宫内膜癌(22-33％)、胃癌(22％)、结直肠癌(10-15％)、甲状腺癌(63％)、皮脂癌(35-60％)，在肝癌、黑色素瘤卵巢癌、壶腹癌、宫颈癌、食管腺癌、软组织瘤、头颈癌、肾癌等中发生率也有一定比例(2-10％)。其中对结直肠癌MSI的研究开展最早、最为深入，而且很多MSI相关理论和应用已经得到广泛认可，被NCCN指南、ASCO指南等推荐应用于临床。
[0004]以研究MSI相对较早和较为深入的结直肠癌为例：有大量证据表明，dMMR/MSI-H是II期结直肠癌患者预后良好的一个标志物，对于具有dMMR/MSI-H肿瘤的II期结直肠癌患者，3/4级分化(低分化)不再认为是高危因素；对于具有dMMR/MSI-H的II期结直肠癌患者，给予5-FU辅助化疗不能带来生存获益，反而会对患者不利。因此，II期CRC患者是否需要辅助化疗，需要综合考虑临床高危因素和MSI状态；随着免疫治疗相关研究的深入以及多款PD1/PD-L1药物上市，MSI检测作为预测PD1/PD-L1药物适用性主要指标之一，其检测需求更加重要和广泛。
[0005]检测MSI结直肠癌的方法主要有检测错配修复蛋白缺陷的免疫组织化学法和基于MSI检测的PCR方法。免疫组织化学检测4种主要的错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，通过检测错配修复蛋白缺失情况反应肿瘤的MSI状态。免疫组织化学法易受组织固定、染色条件等的影响而出现假阳性或假阴性结果，而且操作相对复杂、检测周期较长。
[0006]PCR方法通过扩增特定微卫星序列，根据正常组织与肿瘤组织微卫星序列长度的差异判断肿瘤MSI状态。美国国立癌症研究所(NCI)于1996和2004年颁布了Bethesda指南及该指南修订版。该指南对遗传性非息肉结直肠癌及散发性结直肠癌的MSI检测，推荐检测体系包括五个位点，其中两个位点为单碱基重复，三个为双碱基重复。同时，Bethesda指南确定MSI的标准为：>30％的位点不稳定为MSI-H，10％～30％为MSI-L，<10％为MSS。这一判定标准得到大多数临床和科研工作者认可。由于双碱基重复位点多态性、峰型判定困难以及双碱基重复位点常引起MSI-L检测结果，所以很多研究者认为双碱基重复位点不适合用于检测MSI，应该使用更多的单碱基重复位点。目前已有多款检测单碱基重复位点的体系或产品被广泛应用于科研与临床领域，如本公司基于专利CN201810126825.6的检测试剂盒，作为首款获得国家药品监督管理局批准的MSI检测产品，可用于临床检测。
[0007]液体活检一般指通过体液样本(如外周血、尿液、脑脊液等)而非传统组织样本进
行检测的方法，主要检测对象包括循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)和肿瘤特异抗体等。液体活检具有快速简便、无创、样本量充足、可连续性监测等优点，目前已成为个体化精准治疗研究和应用的热点之一。
[0008]常规的MSI检测是针对肿瘤组织进行的检测，如果能实现液体活检，将大幅扩展MSI检测的应用场景，同时为临床治疗提供更充分有效的辅助信息。液体活检MSI检测相对于传统MSI检测，可能的新应用领域包括：早期肿瘤筛查；术前判断MSI状态以选择适宜的治疗方案，如新辅助放化疗；术后复发检测；难以手术取样组织的检测等。
[0009]液体活检在技术上首要的问题是，如何在大量的正常野生型基因组背景下有效检测目的片段。对于通常的ctDNA液体活检检测，其检测目的片段是来源于肿瘤组织的突变DNA，多数是序列突变或非正常融合的DNA，相对而言还是较易与正常基因组DNA相区别。然而对于MSI检测，其目的片段是不稳定的微卫星位点序列，更难以与正常基因组DNA相区别。以NR27位点为例，正常基因组在该位点序列包含27个连续的A碱基，目的片段不稳定的微卫星位点通常包含15-24个连续的A碱基。从27个连续的A背景下区分15-24个连续的A，显然要比区分SNP、插入、缺失、融合等更为困难。常规技术方案(包括PCR、qPCR、HRM、NGS等)几乎无法实现所需的灵敏度和特异性。
[0010]为了解决上述困难，有研究者通过收集循环肿瘤细胞(CTC)回避灵敏度问题，但利用CTC的检测大幅增加了检测的成本和周期，而且对样本量的要求也更大，这些都不利于其在实际应用中使用。
[0011]目前已有少数通过不同的方法提高MSI检测检测灵敏度的报道，如：(1)通过COLD-PCR技术(How-Kit A,Daunay A,Buhard O,et al.Major improvement in the detection of microsatellite instability in colorectal cancer using HSP110T17E-ice-COLD-PCR[J].Human Mutation,2017.)在PCR中富集不稳定位点并抑制野生型扩增，可以实现对HSP110一个位点的检测；(2)通过NaME-PrO方法(Ladas I,Yu F,Leong KW,et al.Enhanced detection of microsatellite instability using pre-PCR elimination of wild-type DNA homo-polymers in tissue and liquid biopsies[J].Nucleic acids research,2018.
[0012])在扩增前倾向性消化野生型DNA，从而富集不稳定位点。前者虽然操作较简单，但对反应条件要求较高，难以同时检测多个微卫星位点。后者反应条件较为稳定，可以实现多个位点同时检测，但是由于其消化效率不足够高，使得在最终检测结果中还存在非常大量的野生型信号，影响了检测灵敏度，尤其是在多重扩增中这种不利影响尤其明显。
[0013]此现象不仅在微卫星不稳定(MSI)存在，在常规的PCR扩增中同样存在，只是因为在常规的检测中，目标片段与其它片段的碱基差别比较大，其对灵敏度的影响有限，但如果能在扩增之前，将与其它目标片段的片段消化掉，那么在目标片段的PCR扩增中，灵敏度将大大增加。

技术实现思路

[0014]针对上述领域中的需求，本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于降低样本中野生型DNA含量，提高突变型DNA丰度的消化探针设计方法，其特征是：针对于每个待检位点设置一组两条探针，分别对应待检位点的正链和负链；探针与待检测位点野生型DNA序列完全一致或互补，与突变型DNA序列不完全一致；探针3
’
部分与待检位点DNA结合能力较强，5
’
端与待检位点DNA结合能力相对较弱；其中不同位点对应的消化探针与对应野生型目的片段结合应有相同或相近的Tm值；所述消化探针与野生型目的片段结合的Tm值设置高于消化探针与突变型DNA结合的Tm值，同时不同消化探针之间结合成双链的Tm值要足够低。2.根据权利要求1所述的设计方法，所述探针的3
’
部分带有提高双链DNA稳定性的修饰。3.根据权利要求1-2任一所述的设计方法设计得到的微卫星不稳定状态检测中的消化探针，其结构为：探针5
’
端-探针中部-探针3
’
端，所述的探针5
’
端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列3
’
端相邻序列的互补碱基，长度0至3个碱基；所述的探针中部，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列的互补碱基，碱基数量与对应位点野生型目的片段单碱基重复序列的重复数相同，或少一至两个碱基；所述的探针3
’
端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列5
’
端相邻序列的互补碱基，长度4至10个碱基。4.根据权利要求1所述的消化探针，其中探针5
’
端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列3
’
端相邻序列的互补碱基，长度0-2个碱基；探针3
’
端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列5
’
端相邻序列的互补碱基，长度4-6个碱基，所述探针3
’
端区域碱基添加有修饰，或以修饰碱基取代正常碱基，所述修饰包括MGB修饰、荧光基团修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、空间子修饰。5.根据权利要求3所述的消化探针，所述修饰基团为LNA修饰。6.根据权利要求5所述的消化探针，所述微卫星不稳定状态检测为以下6个单核苷酸重复位点中的一个或多个：NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27和MONO27。7.根据权利要求5所述的消化探针，所述消化探针的序列为下表中的一对或多对探针序列示：
其中探针序列中的+为LNA修饰。8.根据权利要求5所述的消化探针，所述消化探针的序列改动1-3个碱基，或者其3
’
端末端进行改动；所述改动包括替换、增加或删除一个或更多个碱基，同时保留其与目的片段特异性结合的能力。9.一种PCR检测试剂盒，含有权利要求1-6任一所述的消化探针，和扩增目的片段的引物组合物。10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，所述目的片段为微卫星不稳定状态检测的6个单核苷酸重复位点：NR21、NR24、BAT25...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈莹，张奇，张颖，张晔，
申请(专利权)人：北京阅微基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：