Taq酶突变体、其制备方法和应用技术

本申请公开了一种Taq酶突变体、其制备方法和应用。本申请中，所述Taq酶突变体包括：与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列；所述氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点发生突变：D335、G499、E634、F769或其组合。本申请提供的Taq酶突变体具有高扩增活性，在同等PCR循环次数下，相比野生型Taq酶可以得到更多的扩增产物、同时耐全血和高盐且不损失5

【技术实现步骤摘要】
Taq酶突变体、其制备方法和应用


[0001]本专利技术实施例涉及PCR检测领域，特别涉及Taq酶突变体、其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]Taq酶是一种来源于耐热性细菌Thermus aquaticus的耐热性DNA聚合酶，分子量94KDa，在镁离子存在的条件下，其最适反应温度为75
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80℃，在95℃下的活性半衰期为40分钟，具有5
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核酸外切酶活性。由于其具有耐高温的特性，因此广泛用于聚合酶链式反应(PCR)，是核酸扩增、检测等反应的首选用酶。商品化Taq酶使用大肠杆菌原核表达系统进行克隆及表达。现代分子生物检测技术对PCR反应的灵敏度、精确度、耐用性要求越来越高，野生型Taq酶无法完全满足实际应用的需求。
[0003]为使其更加适应特定技术的使用，现有技术中对Taq酶序列进行了多种形式的突变改造，例如，(1)增加结构域；(2)去除Taq酶上非必要的结构域；(3)与其他具有3
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外切活性的聚合酶的混合；和(4)定点突变。其中，定点突变指的是对Taq酶上的活性位点、镁离子结合位点、DNA结合位点的氨基酸进行定点突变，以提高各位点对底物、模板及引物的亲和力，进而提高对各种抑制剂的耐受性。
[0004]但是专利技术人在研究中发现，虽然对Taq酶序列进行定点突变可以一定程度上提高DNA聚合活性(Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation ability as a useful reagent for genetic engineering.Front Microbiol 5:461.doi:10.3389/fmicb.2014.00461)，但其致使5
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外切酶活性降低，且突变后的Taq酶不耐全血和高盐，不利于临床检测。
[0005]因此，开发一种不损失5
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外切酶活性的，且耐全血和高盐的Taq酶突变体尤为重要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种Taq酶突变体。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种编码上述Taq酶突变体的核苷酸分子。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种载体。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种宿主细胞。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供一种Taq酶突变体的制备方法。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种含有Taq酶突变体的试剂盒。
[0012]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种Taq酶突变体，所述Taq酶突变体包括：
[0013]与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点发生突变：D335、G499、E634、F769或其组合。
[0014]在一些优选的方案中，所述氨基酸序列发生选自下组的任一种或几种突变：D335V、G499K、E634G和F769I。
[0015]在一些优选的方案中，所述氨基酸序列在下述四个位点发生突变D335V、G499K、E634G和F769I。
[0016]在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对氯化钠的抗性不低于70mM,，更优选不低于80mM，更优选不低于90mM，更优选不低于100mM，更优选不低于130mM，更优选不低于150mM，最优选不低于180mM。
[0017]在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对氯化钾的抗性不低于100mM,，更优选不低于110mM，更优选不低于120mM，更优选不低于130mM，更优选不低于140mM，更优选不低于150mM，更优选不低于180mM，更优选不低于190mM，最优选不低200mM。
[0018]在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对EDTA全血的抗性不低于5％(这里的百分比指的是血浆体积占PCR溶液体系总体积的百分比))，更优选不低于7％，更优选不低于10％，更优选不低于20％，更优选不低于30％，更优选不低于40％，最优选不低于45％。
[0019]在一些优选的方案中，所述Taq酶突变体对肝素全血的抗性不低于1％(这里的百分比指的是血浆体积占PCR溶液体系总体积的百分比)，更优选不低于3％，更优选不低于5％，更
[0020]优选不低于10％，更优选不低于20％，更优选不低于30％，最优选不低于35％。
[0021]SEQ ID NO:1(野生型Taq酶DNA序列如下)：
[0022]ATGCGTGGCATGCTGCCTCTGTTTGAACCGAAAGGCCGCGTGTTACTGGTTGATGGCCATCATCTGGCCTATCGTACCTTTCACGCACTGAAGGGTCTGACCACAAGCCGTGGCGAGCCGGTTCAGGCCGTGTACGGCTTCGCCAAAAGCCTGCTGAAAGCCCTGAAAGAAGACGGCGATGCCGTGATCGTGGTTTTCGACGCCAAGGCACCGAGCTTTCGTCATGAGGCTTATGGTGGCTATAAAGCCGGTCGCGCACCGACACCGGAGGATTTCCCGCGCCAGCTGGCCTTAATTAAAGAGCTGGTGGATCTGTTAGGCCTGGCCCGCCTGGAGGTTCCGGGTTATGAAGCCGACGACGTGCTGGCCAGCTTAGCCAAGAAGGCAGAGAAAGAGGGCTATGAGGTGCGCATTCTGACCGCAGACAAGGACCTGTATCAGCTGCTGAGCGATCGCATTCATGTGCTGCATCCGGAGGGCTACCTGATTACCCCGGCCTGGCTGTGGGAAAAATATGGTCTGCGCCCGGATCAATGGGCAGATTATCGCGCACTGACAGGCGATGAAAGCGATAACCTGCCGGGTGTTAAAGGCATTGGCGAGAAGACAGCACGTAAGCTGCTGGAAGAATgGGGTAgCCTGGAAGCCCTGTTAAAGAACCTGGACCGTCTGAAGCCGGCAATCCGCGAGAAGATTCTGGCCCACATGGATGATCTGAAGCTGAGTTGGGATCTGGCCAAAGTTCGCACAGACTTACCGCTGGAAGTGGACTTTGCCAAGCGTCGTGAACCGGACCGCGAACGTCTGCGTGCCTTCTTAGAACGCCTGGAATTCGGTAGCCTGCTGCACGAATTTGGTCTGCTGGAAAGCCCGAAAGCCTTAGAAGAAGCTCCGTGGCCGCCTCCGGAAGGTGCCTTTGTTGGCTTTGTTCTGAGCCGCAAAGAGCCGATGTGGGCAGATTTACTGGCCCTGGCCGCAGCACGCGGTGGTCGTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Taq酶突变体，其特征在于，所述Taq酶突变体包括：与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列；所述氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点发生突变：D335、G499、E634、F769或其组合。2.根据权利要求1所述的Taq酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列发生选自下组的任一种或几种突变：D335V、G499K、E634G和F769I。3.根据权利要求2所述的Taq酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列在下述四个位点发生突变：D335V、G499K、E634G和F769I。4.根据权利要求1至3任一项所述的Taq酶突变体，其特征在于，所述Taq酶突变体对氯化钠的抗性不低于70mM；和/或，所述Taq酶突变体对氯化钾的抗性不低于100mM。5.根据权利要求1至3任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，张伟，连献兰，陆雪兰，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：