一种组合物及研究蛋白质-DNA互作基因文库的构建方法技术

本申请提供一种组合物及研究蛋白质

【技术实现步骤摘要】
一种组合物及研究蛋白质
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DNA互作基因文库的构建方法


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及一种组合物及研究蛋白质
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DNA互作基因文库的构建方法。

技术介绍

[0002]染色质免疫沉淀(ChIP)是广泛用于研究蛋白质与DNA相互作用的方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与大规模平行DNA测序技术相结合，可以让研究者精确绘制感兴趣蛋白的全局DNA结合位点。ChIP的基本流程是：(1)交联：采用甲醛固定组织或细胞，使DNA与蛋白质紧密结合；(2)片段化：该过程破坏染色质，最终获得用于 ChIP 分析的DNA 片段与蛋白复合物；（3）染色质免疫沉淀：通过加入针对目的蛋白的抗体，结合靶蛋白
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DNA复合物；(4)DNA回收和纯化：回收纯化富集的DNA片段，通过下游检测技术（定量PCR、基因芯片、测序等）分析靶标蛋白特异结合的DNA序列信息（Park P.J., et al.ChIP
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seq: advantages and challenges of a maturing technology.Nat Rev Genet. 2009; 10: 669
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680.）（图1）。然而，因ChIP技术需要对组织或细胞进行甲醛交联，然后再进行DNA片段化，这使得该技术需要极高的细胞起始投入量（百万级），并且很可能因为甲醛过度交联使实验结果存在假阳性。
[0003]为了弥补ChIP的技术缺陷，研究者通过不断的更新与优化，开发了CUT&Run（Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease）技术和CUT&Tag（Cleavage Under Targets & Tagmentation）技术。CUT&Tag以及CUT&Run是研究生物活体细胞中蛋白质与DNA相互作用的技术（Skene, P. J. & Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high
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resolution mapping of DNA binding sites. 2017; eLife 6, e21856. ; Kaya
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Okur HS., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019;10(1):1930.），其通过抗体富集TN5转座酶或Mnase核酸酶，特异切割目的蛋白附近的DNA。再通过对切割后标记的DNA进行文库构建和测序就可以绘制目的蛋白全局的DNA结合位点（图2）。该技术因为不需要交联和物理打断DNA，一定程度的缓解了ChIP技术假阳性和高细胞投入量的缺点。
[0004]虽然CUT&Tag和CUT&Run技术相较ChIP有明显提升，但是CUT&Tag和 CUT&Run依赖PA/PG
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TN5/MNase融合蛋白与二抗Fc段进行结合，然后将TN5/MNase带到目标蛋白区域附近进行DNA切割。此过程一方面受限于PA/PG蛋白与二抗Fc段的结合能力，另一方面抗体的非特异结合以及染色质的可及性都会影响最后的数据。非特异结合的抗体会引导TN5酶或Mnase酶在非靶点区域发生切割，导致最终的结果出现假阳性。此外，转录因子（transcription factors，TF）主要结合在开放染色质区域的核小体耗尽区（nucleosome depleted region，NDR）（Maxime M., et al.Chromatin Fiber Invasion and Nucleosome Displacement by the Rap1 Transcription Factor. Molecular Cell. 2019; 77: 488
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500.）（图3），在CUT&Tag或者CUT&Run实验过程中，异常的染色质状态调节会影响该技术对转录因子靶点以及兴奋性组蛋白修饰靶点的检测，故调节CUT&Tag以及CUT&Run技术中的染
色质状态以及降低抗体的非特异结合能够有效提升该技术的检测能力和最终测序的数据质量。

技术实现思路

[0005]本申请的目的在于提供一种组合物及一种研究蛋白质
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DNA互作的基因文库构建方法，通过降低转座酶结合缓冲液中的盐离子浓度，提升对转录因子靶点以及组蛋白修饰靶点的检测效果，同时降低抗体的非特异结合，减少Cut Tag以及Cut Run实验过程中假阳性。
[0006]本申请的第一方面提供一种组合物，其包含缓冲成分，NaCl，KCl，亚精胺，细胞透化剂和蛋白酶抑制剂，所述NaCl的浓度为10
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300mM，例如10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM，90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM或300mM。
[0007]在一些实施方案中，所述细胞透化剂是例如Tween 20、洋地黄皂苷、皂素、聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇等。
[0008]在一些实施方案中，所述缓冲成分是例如HEPES（4
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羟乙基哌嗪乙磺酸）、Tris、Tris
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HCl、MOPS、PBS等。
[0009]在一些实施方案中，所述组合物包含HEPES，NaCl，KCl，亚精胺，洋地黄皂苷和蛋白酶抑制剂，所述NaCl的浓度为10
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300mM，例如10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM，90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM或300mM。
[0010]在一些实施方案中，所述KCl的浓度为50
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300mM，例如50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM或300mM。
[0011]在一些实施方案中，所述HEPES的浓度为10
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100mM，例如10mM、12mM、15mM、18mM、20mM、22mM、25mM、28mM、30mM、35mM、40mM、45mM和50mM。
[0012]在一些实施方案中，所述亚精胺的浓度为0.1
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5mM，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其包含缓冲成分，NaCl，KCl，亚精胺，细胞透化剂和蛋白酶抑制剂，所述NaCl的浓度为10
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300mM。2.根据权利要求1所述的组合物，所述缓冲成分是HEPES，所述细胞透化剂是洋地黄皂苷。3.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包含10
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50mM HEPES，50
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300mM NaCl，50
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300mM KCl，0.1
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5mM亚精胺，0.01%
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0.1%（质量体积比，1%=1g/100ml）洋地黄皂苷和有效量的蛋白酶抑制剂。4.一种转座酶孵育系统，其包含权利要求1
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3任一项所述的组合物和转座酶复合物。5.一种转座酶反应组合物，其包含权利要求1
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3任一项所述的组合物和二价金属盐。6.一种转座酶反应系统，其包含权利要求4所述的转座酶孵育系统和二价金属盐。7.一种研究蛋白质
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DNA互作基因文库的构建方法，所述方法包含：步骤（1）收集细胞样本，透化，加入靶蛋白结合一抗和二抗进行孵育，所述靶蛋白结合一抗与靶蛋白结合，所述二抗与靶蛋白结合一抗结合；步骤（2）加入转座酶复合物与权利要求1
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3任一项所述的组合物，孵育；步骤（3）加入权利要求5所述的转座酶反应组合物，进行片段化反应从而获得片段化的DNA；其中所述转座酶复合物包含能够与二抗结合的基团或物质、转座酶和含有转座酶识别核心序列（ME序列）和标签序列的寡核苷酸；所述能够与二抗结合的物质是Protein A、Protein G或Protein AG；步骤（4）任选地，纯化片段化的DNA；步骤（5）对DNA片段连接测序接头；步骤（6）任选地，对接头连接后的产物进行纯化和/或扩增。8.根据权利要求7所述的方法，所述透化包括加入含有细胞透化试剂的抗体孵育缓冲液。9.根据权利要求7所述的方法，所述转座酶是Tn5转座酶，所述步骤（5）包括加入与标签序列匹配并带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有测序接头的DNA片段。10.根据权利要求7所述的方法，所述步骤（2）中的孵育步骤包括室温孵育0.5
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2h；所述步骤（3）中的片段化反应包括35
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40℃孵育0.5
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2h。11.一种抗体孵育组合物，其包含HEPES、NaCl、亚精胺、EDT...

【专利技术属性】
技术研发人员：易文洋，许超，聂俊伟，曹林，丁亚慧，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：