一种IL-29生物学活性测定方法技术

本发明专利技术公开了一种IL

【技术实现步骤摘要】
一种IL
‑
29生物学活性测定方法


[0001]本专利技术属于生物学检测
，具体地，涉及一种IL
‑
29生物学活性测定方法。

技术介绍

[0002]生物检定法是利用生物体包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品与其相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。
[0003]生物检定是将供试品和其标准品或参考品在相同的实验条件下同时对生物体或其离体器官组织等的作用进行比较，通过对比，计算出它们的等反应剂量比值（R）。生物检定具有一定的实验误差，其主要来源是生物变异性，因此生物检定必须注意控制生物变异，或减少生物变异本身，或用适宜的实验设计来减少生物变异对实验结果的影响，以减少实验误差。生物检定的可靠性测验要求在实验所用的剂量范围内，剂量或对数剂量的反应（或反应的函数）符合特定模型要求，且标准品与供试品的线性满足计算原理的要求，即满足系统适用性和样品适用性要求，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。四参数模型要求其在所用剂量范围内，对数剂量与反应（或反应的函数）呈S曲线关系，供试品和标准品的S形曲线平行。
[0004]IL
‑
29为III型干扰素IFN
‑
λ1，其抗病毒效应首先需要通过与III型干扰素受体结合，形成IFNLR1
‑
IFN
‑
λ
‑
IL10R2三元络合物，然后和I型干扰素激活相同的Jak
‑
STAT（Janus kinase
‑
signal transducer of transcription）信号传导途径，触发多种具有抗病毒功能的ISGs（干扰素刺激基因）的表达，产生抗病毒的效应。
[0005]虽然IL
‑
29与I型干扰素（包括IFNα及IFNβ）的受体不同，但在信号转导途径的高度相似，因此其生物学活性检测方法可参考I型干扰素。《中国药典》三部通则 3523 干扰素生物学活性测定法 第一法 细胞病变抑制法，该法依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，在波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定I型干扰素生物学活性。
[0006]因此，本领域仍需研发一种能够准确测定IL
‑
29生物学活性的测定方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种能够准确评价IL
‑
29生物学活性测定方法。本专利技术的IL
‑
29生物学活性测定方法测试原理为：依据IL
‑
29可以保护人胚胎肺上皮细胞（L132）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，并对存活的L132细胞染色，在一定波长处测定其吸光度，可得到IL
‑
29对L132细胞的保护效应曲线，以此测定IL
‑
29生物学活性。
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种IL
‑
29生物学活性测定方法，所述方法包括以下步骤：
(1) 病毒扩增：将水泡性口炎病毒（VSV）接种于培养的单层L132细胞中进行病毒扩增，待L132细胞病变达75%~100%时，收集培养上清，所述上清中含有扩增的水泡性口炎病毒；(2) 病毒滴定：使用L132细胞滴定步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID
50
），记半数细胞培养感染时病毒的稀释倍数为1：X，即为病毒滴度；(3) 参考品和供试品溶液制备：将参考品原液和供试品原液进行系列稀释，获得m1个剂量组的参考品溶液和m2个剂量组的供试品溶液，其中m1=m2；(4) 供试品测定：使用L132细胞和所述扩增的水泡性口炎病毒对供试品进行测定，具体包括以下子步骤：(4
‑
a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养T1小时；(4
‑
b) 将步骤(3)中制备的参考品溶液和供试品溶液分别加入接种L132细胞的培养板的检测孔中培养T2小时，对应于每个剂量组设置n个复孔，其中n为2或3；(4
‑
c) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒以1：Y的稀释倍数稀释后加入接种L132细胞的培养板的检测孔中，培养T3小时，其中，X/Y的值为5
‑
20；(4
‑
d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值；(5) 数据处理和结果计算：采用四参数回归计算法进行处理数据，以系列稀释的参考品溶液和供试品溶液的各剂量组的浓度为横坐标，以基于各浓度的复孔计算的吸光度平均值为纵坐标，作参考品和供试品的四参数曲线，并分别计算参考品和供试品的半数有效浓度(EC
50
)，从而计算供试品IL
‑
29生物学相对活性；同时，对测定结果进行可靠性测验，包括参考品和供试品的四参数曲线的曲线拟合度R2以及偏离平行。
[0009]在另一优选例中，在步骤(1)中，收集的培养上清被冷冻保存供后续使用，所述冷冻保存条件为
‑
80℃及以下。
[0010]在另一优选例中，在步骤(1)中，使用完全培养液对L132细胞进行培养，所述完全培养液包含：DMEM培养液，10%的胎牛血清，按所述完全培养液的总体积计。
[0011]在另一优选例中，在步骤(1)中，使用含10%胰酶的DMEM培养液，按1:100稀释水泡性口炎病毒原液（种子液）后，再将其接种于培养的单层L132细胞中进行病毒扩增。
[0012]在另一优选例中，在步骤(2)中，所述病毒滴定具体包括以下步骤：(2
‑
a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养Ta小时；(2
‑
b) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒进行系列稀释；(2
‑
c) 将系列稀释的水泡性口炎病毒加入到接种有L132细胞的检测孔中，培养Tb小时；(2
‑
d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值，从而计算出步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID
50
）,记半数细胞培养感染时病毒的稀释倍数为1：X，即为病毒滴度。
[0013]在另一优选例中，在步骤(2
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a)中，L132细胞接种的密度为1.0
´
105‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IL
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29生物学活性测定方法，所述方法包括以下步骤：(1) 病毒扩增：将水泡性口炎病毒（VSV）接种于培养的单层L132细胞中进行病毒扩增，待L132细胞病变达75%~100%时，收集培养上清，所述上清中含有扩增的水泡性口炎病毒；(2) 病毒滴定：使用L132细胞滴定步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID
50
），记半数细胞培养感染时病毒的稀释倍数为1：X，即为病毒滴度；(3) 参考品和供试品溶液制备：将参考品原液和供试品原液进行系列稀释，获得m1个剂量组的参考品溶液和m2个剂量组的供试品溶液，其中m1=m2，m1(m2)为8
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12；(4) 供试品测定：使用L132细胞和所述扩增的水泡性口炎病毒对供试品进行测定，具体包括以下子步骤：(4
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a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养T1小时；(4
‑
b) 将步骤(3)中制备的参考品溶液和供试品溶液分别加入接种L132细胞的培养板的检测孔中培养T2小时，对应于每个剂量组设置n个复孔，其中n为2或3；(4
‑
c) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒以1：Y的稀释倍数稀释后加入接种L132细胞的培养板的检测孔中，培养T3小时，其中，X/Y的值为5
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20；(4
‑
d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值；(5) 数据处理和结果计算：采用四参数回归计算法进行处理数据，以系列稀释的参考品溶液和供试品溶液的各剂量组的浓度为横坐标，以基于各浓度的复孔计算的吸光度平均值为纵坐标，作参考品和供试品的四参数曲线，并分别计算参考品和供试品的半数有效浓度(EC
50
)，从而计算供试品IL
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29生物学相对活性；同时，对测定结果进行可靠性测验，包括参考品和供试品的四参数曲线的曲线拟合度R2以及偏离平行。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述系列稀释为等比稀释，等比稀释倍数为2
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5倍。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，使用测定培养液进行系列稀释，所述测定培...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴朝阳，陈国友，万涛，
申请(专利权)人：上海惠盾因泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：