基于NSP2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA-LF检测方法技术

本发明专利技术涉及基于NSP2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT

【技术实现步骤摘要】
基于NSP2基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT
‑
RAA
‑
LF检测方法


[0001]本专利技术属于检测
，具体涉及猪繁殖与呼吸综合征通用型RT
‑
RAA
‑
LF检测方法。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种单股正链的RNA病毒，属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，临床症状表现为仔猪呼吸障碍、母猪繁殖障碍、肺部出血、免疫抑制等。根据基因型，猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)分为欧洲型(PRRSV
‑
1)和美洲型(PRRSV
‑
2)，在中国主要流行的是PRRSV
‑
2；PRRSV全长基因组大约在15kb左右，包含10个开放阅读框(ORF)，编码14个非结构蛋白和7个结构蛋白。病毒粒子为直径大小在50
‑
80nm之间的球形或椭圆形，具有囊膜且表面有微绒毛样突起。
[0003]从上世纪九十年代末起，我国开始流行PRRS并分离到PRRSV毒株，2006年我国发现了基因变异的高致病性毒株。PRRS的流行给猪养殖业造成巨大的经济损失，因此早期对PRRS的监测和预防非常关键。从而构建一种能够快速检测PRRSV的RT
‑
RAA
‑<br/>LF可视化方法对PRRS的监测和预防具有重要意义。
[0004]RT
‑
RAA
‑
LF是重组酶介导的扩增技术与核酸检测试纸条结合的检测方法，RAA是在重组酶介导聚合酶在等温条件下对目标序列进行扩增的等温扩增技术，RNA在逆转录酶作用下反转录成cDNA，DNA/cDNA能够在短时间内(10分钟左右)扩增109‑
10
12
倍，扩增产物所带的标记物与试纸条检测线上的抗体结合，在控制线显色后判读结果，若检测线显色为阳性。该技术在各行业已成为热点，广泛应用在食品安全监测、人畜病害防治、植物病害诊断等。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中的至少部分缺陷，本专利技术通过对PRRSV公开序列进行序列比对及分析，基于PRRSV NSP2基因设计一组正反向引物，通过对经典株与高致病株序列进行比对，根据各类毒株的缺失特点，针对性地设计两种探针，通过特异性区分两种毒株，为此设计一种基于PRRSV NSP2基因序列的RT
‑
RAA
‑
LF检测方法。
[0006]本专利技术涉及的一种用于检测PRRSV的NSP2型引物和探针，包括RAA
‑
LF NSP2引物对、RAA
‑
NSP2
‑
Taq1探针和RAA
‑
NSP2
‑
Taq2探针，
[0007]所述RAA
‑
LF NSP2引物对的正向引物核苷酸序列为：
[0008]5'
‑
AGCCTGTCCCCGCCCCGCGCAGGAA
‑
3'，
[0009]反向引物核苷酸序列为：
[0010]5'
‑
Biotin
‑
CAGTCTGTGAGGAAGCAGACAAATC
‑
3'；
[0011]所述RAA
‑
NSP2
‑
Taq1探针为，
[0012]5'
‑
FITC
‑
GTGCCCGCGTCGCGACGTGTCTCCAAGCTG(THE)TGACACCTTTGAGTG
‑
C3 Spacer
‑
3'，用于鉴别高致病毒株；
[0013]所述RAA
‑
NSP2
‑
Taq2探针为，
[0014]5'
‑
FITC
‑
GCCGATCCCTGTGCCCGCACCGCGGCGTAA(THE)TTTCAGCAGGTGAA
‑
C3 Spacer
‑
3'，用于鉴别经典株；
[0015]本专利技术涉及一种检测PRRSV的RT
‑
RAA扩增试剂，包括RAA
‑
LF NSP2引物对、RAA
‑
NSP2
‑
Taq1探针和RAA
‑
NSP2
‑
Taq2探针。
[0016]进一步地，所述RT
‑
RAA扩增试剂还包括A Buffer、B Buffer和水。
[0017]本专利技术还涉及检测PRRSV的RT
‑
RAA扩增试剂在检测PRRSV的应用，包括以下步骤，
[0018]S1、使用核酸提取试剂盒结合Vazyme全自动核酸提取仪提取待测基因组RNA；
[0019]S2、以步骤S1提取的待测样品RNA为模板，以所述特异性引物RAA
‑
LF NSP2作为扩增引物，进行等温扩增；
[0020]S3、检测结果判定：将扩增产物用ddH2O稀释5倍，再用试纸条专用缓冲液稀释5倍，待测溶液至少100μl，随后将试纸条直立于待测溶液中检测，直至控制线显色立即判读结果。
[0021]进一步地，所述步骤S1包括，
[0022]S1.1、处理样本：组织样品加入1ml无菌PBS缓冲液研磨后待用；拭子样品加入1ml无菌PBS缓冲液，拭子在离心管内涮后弃，液体样品待用；血样可直接用于核酸提取。待提样品体积为200μl，不足则加入PBS至200μl。
[0023]S1.2、取出预封装试剂，颠倒混匀数次使磁珠重悬，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，使用前确认板子方向并小心撕去铝箔封口膜；
[0024]S1.3、自动化仪器提取：在96孔板试剂第1列和第7列孔中先后加入200μl样品和20μl Proteinase K溶液；将96深孔板放入核酸提取仪中，装入磁棒套，按照程序自动化提取。
[0025]进一步地，所述步骤S2包括，
[0026]扩增体系(50μl)：A Buffer40.9μl，正反向引物(2μM)各2μl，探针(2μM)0.6μl，模板RNA 2μl，B Buffer2.5μl。
[0027]扩增条件：在恒温39℃下反应10min。
[0028]加样操作：将A Buffer、正反向引物、探针、模板混匀后加入反应干粉中，再混匀，然后加入B Buffer后振荡混匀并离心10s，放入恒温器中进行扩增。
[0029]本专利技术的有益之处在于：PRRSV NSP2基因编码的蛋白属非结构蛋白，其基因序列是整个PRRSV基因组中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PRRSV的NSP2型引物和探针，包括RAA
‑
LF NSP2引物对、RAA
‑
NSP2
‑
Taq1探针和RAA
‑
NSP2
‑
Taq2探针，其特征在于，所述RAA
‑
LF NSP2引物对的正向引物核苷酸序列为：5'
‑
AGCCTGTCCCCGCCCCGCGCAGGAA
‑
3'，反向引物核苷酸序列为：5'
‑
Biotin
‑
CAGTCTGTGAGGAAGCAGACAAATC
‑
3'；所述RAA
‑
NSP2
‑
Taq1探针为，5'
‑
FITC
‑
GTGCCCGCGTCGCGACGTGTCTCCAAGCTG(THE)TGACACCTTTGAGTG
‑
C3 Spacer
‑
3'，用于鉴别高致病毒株；所述RAA
‑
NSP2
‑
Taq2探针为，5'
‑
FITC
‑
GCCGATCCCTGTGCCCGCACCGCGGCGTAA(THE)TTTCAGCAGGTGAA
‑
C3 Spacer
‑
3'，用于鉴别经典株。2.一种检测PRRSV的RT
‑
RAA扩增试剂，其特征在于，所述的RT
‑
RAA扩增试剂包括权利要求1所述的引物和探针。3.根据权利要求2所述的检测PRRSV的RT
‑
RAA扩增试剂，其特征在于：所述RT
‑
RAA扩增试剂还包括A Buffer、B Buffer和水。4.根据权利要求2
‑
3任一项所述的检测PRRSV的RT
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹宗喜，黄春媛，刘光亮，马佳镁，陈素贞，张艳，郑佳馨，范悦轩，
申请(专利权)人：海南省农业科学院三亚研究院海南省实验动物研究中心，
类型：发明
国别省市：