检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合及其应用。本发明专利技术首先公开了用于检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合物，包括特异性加尾引物对、通用引物对和超短探针，序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术涉及动物检疫领域。更具体地，涉及一种用于检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]东部马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis virus，EEEV)为披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Genus Alphavirus)成员，为有囊膜的单链RNA病毒，传染性强、致死率高，能感染人和多种动物，被国际社会列为防生物恐怖的主要对象之一。可引起人和动物的脑脊髓炎，临床上，表现为持续高热和严重神经症状。与日本脑炎症状很相似，对人致死率最高可达90％，亚临床感染病例，症状轻微。自然界中，EEEV可在鸟类和蚊子之间交替传播，人和马是EEEV的终末宿主。
[0003]EEEV基因组全长为11.7kb。基因组编码4种非结构蛋白(NSP1～4)和5种结构蛋白(衣壳蛋白C，囊膜糖蛋白E1、E2、E3，6K，基因排列顺序5
’‑
C
‑
E3
‑
E2
‑
6K
‑
E1
‑3’
)。其中E2蛋白是该病的主要保护性抗原，具有7个部分重叠的抗原表位，分别与血凝抑制、中和病毒和抗病毒感染活性有关。
[0004]EEEV为重要人畜共患病，我国农业农村部和海关总署将其列为进境动物检疫二类传染病，随着动物国际贸易的日益繁荣，特别是各大型国际体育赛事的日益频繁，出入境的马匹越来越多，同时由于参赛马匹来自不同的国家和地区，健康状况参差不齐，疫情非常复杂，这些因素都可能危害我国养马业的发展和马术运动的正常开展，因此开展EEEV的检测技术就显得尤为重要。
[0005]本病的确诊须依靠病毒分离、鉴定，病毒抗原检测，核酸快速检测方法以及特异性血清学检测方法。病毒分离材料需要有新鲜的马和其他发病动物的脑以及媒介昆虫组织。可以将待检材料接种小鼠、豚鼠、鸡胚、新生雏鸡或仓鼠肾原代细胞、鸡胚或鸭胚原代细胞以及BHK
‑
21细胞株进行病毒分离。3周龄以下小鼠脑内接种分离病毒方法最为敏感。病毒鉴定通常采用交叉中和试验进行。亚型和抗原变异株的鉴定可以用针对E1或E2糖蛋白的单抗进行血凝抑制试验(HI)或者采用寡核苷酸指纹图谱技术加以鉴别。抗原检测方法包括固相反向补体结合试验，免疫电镜，双抗体夹心ELISA检测方法，间接免疫荧光方法。特异性抗体检测方法包括中和试验，血凝抑制试验和ELISA检测方法。分子生物学检测方法由于快速简便，已经开始应用于EEEV的快速诊断和检测，特别是荧光RT
‑
PCR检测技术更为快速和特异，因此，如何开发出用于检测东部马脑脊髓炎病毒的特异性强、灵敏度更高的荧光定量RT
‑
PCR检测方法依然是研发人员不断追求的目标。

技术实现思路

[0006]针对目前的上述问题，本专利技术的一个目的在于提供用于检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合物、试剂盒及其应用。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供利用上述引物探针组合物或试剂盒检测东部马脑脊
髓炎病毒的方法，该方法灵敏、特异，可以快速、准确、定量的检测出待测样本是否感染了东部马脑脊髓炎病毒。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了用于检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合物，所述组合物包括特异性加尾引物对、通用引物对和超短探针；
[0010]所述特异性加尾引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
[0011]SEQ ID NO.1：5
’‑
GGCTTTCCACGACCACGGCCGGCTTTTTTACTTGTCTG
‑3’
，(正义引物)；
[0012]SEQ ID NO.2：5
’‑
TTCCACGGTATCCACGTACGGGATCCCCACCTTGTTC
‑3’
，(反义引物)；
[0013]所述通用引物对为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列：
[0014]SEQ ID NO.3：5
’‑
TT+CCAC+GAC+CAC
‑3’
，(正义引物)；
[0015]SEQ ID NO.4：5
’‑
CAC+GGTAT+C+CAC
‑3’
，(反义引物)；
[0016]其中，“+”后面的核苷酸代表LAN修饰核苷酸；
[0017]所述超短探针为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列：
[0018]SEQ ID NO.5：5
’‑
C+G+C+C+T+TG+GGC
‑3’
；
[0019]其中，“+”后面的核苷酸代表LAN修饰核苷酸。
[0020]进一步，所述超短探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团。
[0021]根据本专利技术的具体实施方式，所述超短探针的5
’
端标记的荧光报告基团为FAM，3
’
端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。
[0022]第二方面，本专利技术提供了上述引物探针组合物在制备检测东部马脑脊髓炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。
[0023]第三方面，本专利技术提供了一种用于检测东部马脑脊髓炎病毒的试剂盒，所述试剂盒含有上述检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合物。
[0024]进一步，所述试剂盒还包括荧光定量RT
‑
PCR反应所需试剂，例如荧光定量RT
‑
PCR反应液、阴性对照、阳性对照、水等中的至少一种，所述荧光定量RT
‑
PCR反应液可包括缓冲液、dNTP、BSA、M
‑
MLV反转录酶、RNA酶抑制剂和Taq DNA聚合酶等。
[0025]进一步，所述阴性对照可为马抗凝血，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成5％液体。
[0026]进一步，所述阳性对照可为含有目的扩增基因的体外转录RNA；
[0027]例如可以按照中国专利CN102808043A中公开的方法制备阳性对照品。
[0028]本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物和TaqMan探针进行单独包装的步骤。
[0029]第四方面，本专利技术提供了检测东部马脑脊髓炎病毒的方法(TaqMan探针荧光定量RT
‑
PCR检测法)包括如下步骤：
[0030]1)提取待测样品中的RNA；
[0031]2)以步骤1)提取的RNA为模板，利用上述的引物探针组合物或试剂盒进行荧光定量RT
‑
PCR扩增反应；
[0032]3)结果判断。
[0033]进一步，所述荧光定量RT
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测东部马脑脊髓炎病毒的引物探针组合物，其特征在于，所述组合物包括特异性加尾引物对、通用引物对和超短探针；所述特异性加尾引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.1：5
’‑
GGCTTTCCACGACCACGGCCGGCTTTTTTACTTGTCTG
‑3’
；SEQ ID NO.2：5
’‑
TTCCACGGTATCCACGTACGGGATCCCCACCTTGTTC
‑3’
；所述通用引物对为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.3：5
’‑
TT+CCAC+GAC+CAC
‑3’
；SEQ ID NO.4：5
’‑
CAC+GGTAT+C+CAC
‑3’
；其中，“+”后面的核苷酸代表LAN修饰核苷酸；所述超短探针为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.5：5
’‑
C+G+C+C+T+TG+GGC
‑3’
；其中，“+”后面的核苷酸代表LAN修饰核苷酸。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述超短探针的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高志强，汪琳，蒲静，白子龙，张小寒，杜思乐，赵相鹏，张伟，尹羿，任彤，张佳玮，赖平安，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：