【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体说涉及一种用于识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
1、人表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)是一种由53个氨基酸组成的单链低分子量多肽，主要分布于人体各种组织的细胞外液中。egf主要通过egfr发挥其功能，egf与egfr结合后，可激活包括ras-raf-mapk、 jak-stat、pi(3)k-akt等在内的多条信号通路。近年来研究显示：在许多实质性肿瘤如神经胶质细胞瘤、乳腺癌肺癌、卵巢癌、头颈部磷癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等中egf及egfr均有过度表达。多种肿瘤通过自分泌和旁分泌的方式产生大量egf，从而使egfr通路过度活化。过度活化的egfr通过多条传导信号通路，增强转录、转录后活动或基因表达，使细胞表型发生转化，进而导致肿瘤的发生、发展。因此，降低肿瘤细胞内egf 的含量，对于抑制肿瘤细胞的增殖、肿瘤细胞间的信号传导，进而抑制肿瘤的发展具有举足轻重的作用。
2、重组egf-crm197肿瘤治疗性疫苗（以下简称“重组egf-crm197疫苗”）是一种egf与载体蛋白crm197交联而成的新型结合疫苗，由上海惠盾生物技术有限公司研发，该疫苗已通过cde审评，获得了国家i类新药的临床试验批文（批件号：2017l04930），目前已完成ⅰ期临床试验，正在开展ⅱ期临床试验。该疫苗的主要机制是诱导患者体内产生高水平的抗egf抗体，中和体内的egf，从而抑制egf/egfr信号通路，进而抑制依赖该信号通路的肿
3、疫苗效价是重组egf-crm197疫苗的最重要的放行质量标准。常用的检测疫苗效价的方法为将疫苗免疫小鼠或豚鼠后，进行体内攻毒实验或获取血清进行抗体滴度测定，该方法操作复杂且耗时较长。参照2020年版中国药典“甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法”，通过比对不同批次重组egf-crm197疫苗中抗原（egf）量与理化对照品的比值，我们建立了重组egf-crm197疫苗体外相对效力的测定方法，该方法中采用的捕获抗体为重组egf-crm197疫苗免疫小鼠后制备的单克隆抗体，该抗体可有效的与包被疫苗中的抗原结合，敏感度远高于商用购买的单克隆抗体。
4、此外，在临床使用中，重组egf-crm197疫苗免疫后诱导产生的中和抗体，中和患者血清中的egf，从而发挥抗肿瘤效应，因此，血清中egf浓度的下调也是评价疫苗免疫效能的重要衡量指标，研发一种特异性识别重组egf-crm197的单克隆抗体，作为egf定量elisa检测试剂盒的捕获或检测抗体，可用于定量检测免疫重组egf-crm197疫苗的患者，血清中egf的浓度，进而评估重组egf-crm197疫苗的有效性，为患者加强免疫提供依据。
5、综上所述，研发一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，可用于检测重组egf-crm197疫苗的体外相对效力，为重组egf-crm197临床使用前进行质量控制提供了一种有力的手段；此外，一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，可用于人egf定量elisa检测试剂盒的制备。因此，伴随重组egf-crm197疫苗的开发及临床应用，研发一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供了一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够结合重组egf-crm197疫苗，在评价重组egf-crm197相对效价和临床分析中，评价疫苗免疫效能方面发挥了重要作用。
2、为达到此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面：本专利技术提供一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链vl-cdr1的氨基酸序列为seq id no.1，轻链vl-cdr2的氨基酸序列为seq idno.2，轻链vl-cdr3的氨基酸序列为seq id no.3；
4、所述单克隆抗体的重链vh-cdr1的氨基酸序列为seq id no.4，重链vh-cdr2的氨基酸序列为seq id no.5，重链vh-cdr3的氨基酸序列为seq id no.6。
5、所述seq id no.1如下所示：
6、divltqspaslavslgqratiscras ksvitsgysy
7、所述seq id no.2如下所示：
8、mhwyqqkpgqppklliy las
9、所述seq id no.3如下所示：
10、nlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyyc qhsrelpft
11、所述seq id no.4如下所示：
12、evqlqqsgpelvkpgasvkmsckas gytftsyi
13、所述seq id no.5如下所示：
14、lhwvkqrpgqgldwigy inpyndgt
15、所述seq id no.6如下所示：
16、kynekfkgkatltsdkssstaymelssltsedsavyyc arwgwvvatdytmdy
17、进一步的，所述抗体的轻链包括三个轻链cdr以及连接轻链cdr的轻链框架区；所述抗体的重链包括三个重链cdr以及用于连接重链cdr的重链框架区；
18、进一步的，所述单克隆抗体用于制备评估重组egf-crm197疫苗体外相对效力的试剂盒或定量检测血清中egf浓度的elisa试剂盒。
19、本专利技术还提供了一种制备单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
20、步骤1：动物免疫：采用6周龄的balb/c 小鼠，抗原为重组egf-crm197疫苗。免疫途径为皮下注射；每周给药1次，共给药4次。
21、步骤2：细胞融合：将步骤（1）中优选出的小鼠，制备脾细胞悬液。取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞开始融合，采用peg介导的融合法进行融合。
22、步骤3：杂交瘤细胞的筛选：扩增步骤（2）中的杂交瘤细胞，取上清检测elisa效价及抗体亚型，选取针对egf抗原呈阳性的细胞进行克隆。为保证杂交瘤细胞株的阳性率和稳定地产生抗体，进行3-4次克隆，选取3-4次筛选均为100%阳性的克隆。
23、步骤4：杂交瘤细胞的克隆化：将步骤（3）筛选出的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞s-172-4细胞；
24、步骤5：单克隆抗体的制备：裸鼠腹腔提前一周注射液体石蜡0.5 ml，将步骤（4）得到的s-172-4细胞用生理盐水调整至5×106/ml，腹腔注射200 µl，7-10天后，收集小鼠腹水。腹水通过protein a层析柱纯化，先用a液 pb ph7.0 平衡层析柱，腹水样品上柱后，采用b液 0.1 m 甘氨酸-hcl ph2.7，线本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链VL-CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，轻链VL-CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，轻链VL-CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3；
2.根据权利要求1所述识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链包括三个轻链CDR以及连接轻链CDR的轻链框架区；所述抗体的重链包括三个重链CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区。
3.一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体用于制备评估重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力的试剂盒或定量检测血清中EGF浓度的ELISA试剂盒。
4.根据权利要求3所述的识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体的应用，其特征在于，当所述单克隆抗体用于制备评估重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力的试剂盒时，重组EGF-CRM197浓度在7.8~1000pg/ml之间，显示出良好的线性关系。
5.根据权利要求3所述的识别重组EGF-CR
...【技术特征摘要】
1.一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链vl-cdr1的氨基酸序列为seq id no.1，轻链vl-cdr2的氨基酸序列为seq id no.2，轻链vl-cdr3的氨基酸序列为seq id no.3；
2.根据权利要求1所述识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链包括三个轻链cdr以及连接轻链cdr的轻链框架区；所述抗体的重链包括三个重链cdr以及用于连接重链cdr的重链框架区。
3.一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体用于制备评估重组egf-crm...
【专利技术属性】
技术研发人员：万涛，吁亭，范季瀛，
申请(专利权)人：上海惠盾因泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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