抗表皮生长因子抗体酶联免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了抗表皮生长因子(EGF)抗体酶联免疫检测试剂盒。具体地，本发明专利技术提供了一种检测试剂盒，其特征在于，包括：(a)酶标板，所述酶标板为包被有EGF抗原的酶标板；和(b)液体试剂，所述液体试剂包括：(b1)抗人EGF抗体标准品；(b2)样本稀释液；(b3)洗涤液；(b3)HRP标记的抗人IgG抗体工作液；(b4)底物，所述底物为HRP标记的抗人IgG抗体的底物；和(b5)终止液。本发明专利技术的试剂盒采用抗人EGF抗体浓度阳性的血清制备为标准品，可通过标准品检测结果拟合的标准曲线，定量检测临床患者血清中抗EGF抗体浓度，操作简便，灵敏度高，精密度高，准确度高，且能用于大批量样品的快速定量检测，可以作为伴随检测试剂盒，满足以EGF为抗原的相关疫苗临床使用需求。临床使用需求。

【技术实现步骤摘要】
抗表皮生长因子抗体酶联免疫检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种抗表皮生长因子(EGF)抗体酶联免疫检测试剂盒。

技术介绍

[0002]人表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种由53个氨基酸组成的单链低分子量多肽，主要分布于人体各种组织的细胞外液中，首次由美国科学家Cohen于1962年从小鼠颌下腺分离出来。EGF通过自分泌或旁分泌作用于靶细胞，能够促进细胞的有丝分裂、刺激胚胎的生长和发育、增加物质的转运与代谢等，具有广泛的生理作用。EGF主要通过EGFR发挥其功能，EGF与EGFR结合后，在EGF诱导下，EGFR被活化，EGFR的三维构象发生改变，使EGFR形成同源二聚体或异源二聚体。EGF/EGFR可激活包括Ras-Raf-MAPK、JAK-STAT、PI(3)K-Akt等在内的多条信号通路。近年来研究显示：在许多实质性肿瘤如神经胶质细胞瘤、乳腺癌肺癌、卵巢癌、头颈部磷癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等中EGF及EGFR均有过度表达。多种肿瘤通过自分泌和旁分泌的方式产生大量EGF，从而使EGFR通路过度活化。过度活化的EGFR通过多条传导信号通路，增强转录、转录后活动或基因表达，使细胞表型发生转化，进而导致肿瘤的发生、发展。因此，降低肿瘤细胞内EGF的含量，对于抑制肿瘤细胞的增值、肿瘤细胞间的信号传导，进而抑制肿瘤的发展具有举足轻重的作用。
[0003]以EGF为基础的肿瘤治疗性疫苗，以人EGF为靶点，通过激发机体产生高滴度抗EGF抗体，中和体内的EGF阻断EGF-EGFR通路继而抑制肿瘤细胞生长，从而达到治疗癌症的作用。古巴分子生物研究所研发的CIMAvax-EGF于2008年，经古巴药品监督管理局批准用于一线化疗后ⅢB/Ⅳ非小细胞肺癌(NSCLC)期患者的转换维持治疗，共超过5000名肿瘤晚期患者在不同的临床实验中接种了该疫苗。CIMAvax-EGF疫苗临床结果表明，疫苗会诱导产生高水平的抗EGF抗体，使得血清中EGF浓度保持低至无法检测水平，抗EGF抗体滴度水平高的患者，生存期较对照组显著延长。EGF疫苗免疫后的抗EGF抗体水平是以EGF为基础的疫苗临床试验和应用中需要监测的重要免疫学指标，对于肿瘤患者的预后和后期用药指导具有指导意义。
[0004]现有技术中采用常规的抗人EGF抗体滴度检测，其采用间接ELISA法，样本孔OD值/阴性质控品OD值≥2.1时最大的血清稀释倍数，即为待测样品抗体滴度(具体见专利：ZL201720210309.2)，EGF抗体滴度检测方法中没有标准曲线校准，板间精密度差，检测结果误差一般在50％-200％。同时，一块96孔的酶标板最多仅能检测6个血清样本，工作量大。常规的抗常规的抗EGF抗体滴度检测方法无法满足快速、精确定量、高通量的检测需求。
[0005]综上所述，本领域迫切需要开发一种快速、高精密度、能高通量检测血清中抗EGF抗体含量的检测试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种快速、高精密度、高准确性、高通量定量检测人血清中抗
EGF抗体的检测试剂盒。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种检测试剂盒，包括：
[0008](a)酶标板，所述酶标板为包被有EGF(表皮生长因子)抗原的酶标板；和
[0009](b)液体试剂，所述液体试剂包括：
[0010](b1)抗人EGF抗体标准品溶液；
[0011](b2)样本稀释液；
[0012](b3)洗涤液；
[0013](b4)HRP标记的抗人IgG抗体工作液；
[0014](b5)底物，所述底物为HRP标记的抗人IgG抗体的底物；和
[0015](b6)终止液。
[0016]在另一优选例中，所述的EGF抗原为重组人EGF抗原。
[0017]在另一优选例中，所述酶标板包被有0.1～1μg/孔的EGF抗原。
[0018]在另一优选例中，所述酶标板经封闭液封闭。
[0019]在另一优选例中，所述的封闭液为含1～3％(w/v)的BSA(最佳地2％(w/v))、2～4％(w/v)的蛋白保护剂HT-HY(最佳地2％(w/v))、0.1～0.5％(v/v)的吐温-20(最佳地0.5％(w/v))的PBS缓冲液。
[0020]在另一优选例中，所述的酶标板为96孔酶标板。
[0021]在另一优选例中，所述的抗人EGF抗体标准品溶液由免疫以重组人EGF为基础疫苗后的受试者，诱导产生含高浓度抗EGF抗体的血清制备而成。
[0022]在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：质控品。
[0023]在另一优选例中，所述的质控品包括：阳性质控品和阴性质控品。
[0024]在另一优选例中，所述的阳性质控品为通过下述方法制备的阳性质控品：取多份抗EGF抗体滴度阳性的患者血清，混合离心后取上清，将上清用样本稀释液进行合适比例稀释后血清稀释样品。
[0025]在另一优选例中，所述的阳性质控品检测OD值为0.5～1.0。在另一优选例中，所述的阴性质控品制备为通过下述方法制备的阴性质控品：取多份正常人血清，等比例混合离心后，将上清用样本稀释液进行合适比例稀释后，混合离心后取上清，将上清用样本稀释液进行合适比例稀释后的血清稀释样品。
[0026]在另一优选例中，所述的阴性质控品检测OD值≤0.3。
[0027]在另一优选例中，所述的洗涤液为浓缩洗涤液。
[0028]在另一优选例中，所述浓缩洗涤液为含0.1～0.5％(v/v)吐温-20(最佳地0.5％)，0.8-1.5g/L硫酸庆大霉素(最佳地1％)的10
×
PBS缓冲液(即10倍浓缩的PBS缓冲液)。
[0029]在另一优选例中，吐温-20、和硫酸庆大霉素的用量比为缓吐温-20(ml)：硫酸庆大霉素(g)＝1～5:0.8～1.5(最佳地，＝5:1)。
[0030]在另一优选例中，所述洗涤液的pH值为7.4
±
0.2。
[0031]在另一优选例中，每1L所述的浓缩洗涤液包括1～5ml的吐温-20。
[0032]在另一优选例中，每1L所述的浓缩洗涤液包括0.8～1.5g(最佳地，1g)的硫酸庆大霉素。
[0033]在另一优选例中，每1L所述的浓缩洗涤液包括下述组分：
[0034]吐温-201～5ml硫酸庆大霉素0.8～1.5g(最佳地，1g)10倍浓缩的PBS缓冲液余量
[0035]并且所述浓缩洗涤液的pH值为7.4
±
0.2。
[0036]在另一优选例中，所述样本稀释液的pH值为7.4
±
0.2。
[0037]在另一优选例中，每1L所述的样本稀释液包括10～15g(较佳地，10～12g)的HT-AEP蛋白保护剂。
[0038]在另一优选例中，每1L所述的样本稀释液包括下述组分：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测试剂盒，其特征在于，包括：(a)酶标板，所述酶标板为包被有EGF(表皮生长因子)抗原的酶标板；和(b)液体试剂，所述液体试剂包括：(b1)抗人EGF抗体标准品溶液；(b2)样本稀释液；(b3)洗涤液；(b4)HRP标记的抗人IgG抗体工作液；(b5)底物，所述底物为HRP标记的抗人IgG抗体的底物；和(b6)终止液。2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的EGF抗原为重组人EGF抗原。3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的抗人EGF抗体标准品溶液由在至少稀释1000～3000倍后OD值≥1的血清样本制成。4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒可通过拟合标准曲线，定量检测临床患者中抗EGF抗体浓度。5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标板经封闭液封闭，且所述的封闭液为含1～3％(w/v)的BSA、2～4％(w/v)的蛋白保护剂HT-HY、0.1～0.5％(v/v)的吐温-20的PBS缓冲液。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国友，
申请(专利权)人：上海惠盾因泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：