一种支气管哮喘辅助诊断试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种支气管哮喘辅助诊断试剂。检测脯氨酸的试剂在制备支气管哮喘辅助诊断试剂中的应用。提取及检测脯氨酸的试剂在制备支气管哮喘辅助诊断试剂中的应用。一种支气管哮喘辅助诊断试剂，包含从血清中提取脯氨酸的试剂，以及定量检测脯氨酸的试剂。本发明专利技术首次发现哮喘患者的血浆脯氨酸水平高于正常人，有统计学意义。脯氨酸截断值为38.7ug/mL时，诊断哮喘ROC曲线下面积为0.951(P＜0.0001)，表明诊断效能较大。血浆脯氨酸作为生物标志物，标本易取，不需肺泡灌洗，属于无创检查，可辅助哮喘的早期诊断，脯氨酸检测方法经济，容易开展，为支气管哮喘的诊断治疗提供了潜在靶点。为支气管哮喘的诊断治疗提供了潜在靶点。为支气管哮喘的诊断治疗提供了潜在靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种支气管哮喘辅助诊断试剂


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种支气管哮喘辅助诊断试剂。

技术介绍

[0002]支气管哮喘是一种以慢性气道炎症、气道重塑、气道高反应性为特征的异质性疾病。全世界约有3亿哮喘患者，我国哮喘患者人数超过4000万。近年来，随着工业化的进展，我国哮喘的患病率仍在逐年上升，带来了沉重的家庭和社会负担。由于哮喘的异质性，哮喘具有多种表型和内型。全球哮喘防治创议(GINA)2020将哮喘分为以下几种表型：过敏性哮喘、非过敏性哮喘、迟发型哮喘、哮喘伴固定气流受限、哮喘伴肥胖。不同表型的哮喘人群对于药物尤其是吸入性糖皮质激素(ICS)的治疗反应也不尽相同。哮喘的反复发作还会引起各种并发症，比如肺气肿，肺心病，心衰等。
[0003]传统的哮喘诊断主要依靠临床表现，肺功能检查，峰流速检测，但上述技术不易检测到症状不明显的哮喘患者，随着生物技术的发展，生物标志物为哮喘的诊断提供了一种新的途径。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是针对现有不足，提供一种新型的能特异性协助诊断支气管哮喘的生物标志物的应用。
[0005]本专利技术的另一目的是提供一种支气管哮喘辅助诊断试剂。
[0006]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0007]检测脯氨酸的试剂在制备支气管哮喘辅助诊断试剂中的应用。
[0008]提取及检测脯氨酸的试剂在制备支气管哮喘辅助诊断试剂中的应用。
[0009]一种支气管哮喘辅助诊断试剂，包含从血清中提取脯氨酸的试剂，以及定量检测脯氨酸的试剂。
[0010]作为本专利技术的一种优选，所述的支气管哮喘辅助诊断试剂包含磺基水杨酸、茚三酮及甲苯。
[0011]有益效果：
[0012]本专利技术首次发现哮喘患者的血浆脯氨酸水平高于正常人，有统计学意义(图1)。脯氨酸截断值为38.7ug/mL时，诊断哮喘ROC曲线下面积为0.951(95％置信区间：0.866
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0.989，P＜0.0001)，有统计学意义，且诊断效能较大(图2)，敏感度为88.2％，特异度为90％。血浆脯氨酸作为生物标志物，标本易取，不需肺泡灌洗，属于无创检查，可辅助哮喘的早期诊断，脯氨酸检测方法经济，容易开展，并为支气管哮喘的诊断治疗提供了潜在靶点。
附图说明
[0013]图1：健康人(control)和哮喘患者(asthma)外周血脯氨酸含量
[0014]图2：脯氨酸诊断哮喘的ROC曲线
具体实施方式
[0015]实施例1
[0016]1.外周血样本的采集和冻存
[0017]34例支气管哮喘患者的外周血标本来自于江苏省人民医院，30例健康人的标本来自于南京医科大学在校大学生。采集正常人以及哮喘患者的外周血与抗凝管中，1000rpm/min离心5分钟，收集上层血浆，冻存于
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80℃
[0018]2.检测人血浆中脯氨酸的表达
[0019]本试剂盒应用脯氨酸检测试剂盒测定血浆标本中人脯氨酸水平。用磺基水杨酸(SA)提取脯氨酸，脯氨酸便游离在磺基水杨酸的溶液中，用茚三酮加热处理后，溶液中的脯氨酸与酸性茚三酮溶液反应，颜色变成红色，该物质在甲苯中溶解度更大，利用甲苯萃取后，红色的色素全部转移至甲苯中，色素的深浅和脯氨酸含量呈正相关，用酶标仪在520nm波长下测定吸光度(OD值)，根据标准曲线计算出人血浆脯氨酸的含量。具体方法如下：
[0020](1)样本处理：取0.1mL血浆加入0.9mL含磺基水杨酸的脯氨酸提取液(样品被稀释了10倍)，充分混匀后，在100℃沸水浴中边振荡边提取10分钟。离心机10000g常温离心10分钟，冷却后待测。
[0021](2)标准品的配置：脯氨酸标准品离心，10mg脯氨酸标准品加入1mL蒸馏水混匀，配成10mg/mL的原液，取10ul原液加入90ul蒸馏水充分混匀，该标准品最终浓度为1mg/mL。准备小试管8只，依次编好号码，先在各小试管中依次加入蒸馏水970ul、980ul、990ul、992ul、500ul、500ul、500ul、500ul，然后分别取最终浓度标准品30ul、20ul、10ul、8ul依次加入第一支、第二支、第三支、第四支已编好号的试管中，充分混匀；再在第四支试管中取500ul加入第五支试管中，充分混匀；再在第五支试管中取500ul加入第六只试管中，充分混匀；再在第六只试管中取500ul加入第七支试管中，充分混匀，然后在该试管中取500ul，弃掉。第八只试管作为0号标准品。稀释后各管浓度分别是：30ug/mL,20ug/mL,10ug/mL,8ug/mL,4ug/mL,2ug/mL,0ug/mL。
[0022](3)加酸性茚三酮：取0.25mL样品上清液在2mL有盖的EP管中，加入0.25ml酸性冰乙酸，再加入0.25mL含有茚三酮的溶液，取0.25mL标准品在2mL有盖的EP管中，加入0.25mL酸性冰乙酸，再加入0.25mL含有茚三酮的溶液。将EP管置100℃沸水浴振荡孵育30分钟(要把盖子盖紧，防止水分蒸发)，每10分钟振荡一次。
[0023](4)加甲苯萃取：待溶液冷却后，在EP管中加入0.5mL甲苯，振荡30秒，静置1分钟，使红色色素转移到甲苯中。
[0024](5)加样：吸取0.2mL上层红色溶液于EP管中，充分混匀。设标准品孔和待测样品孔，在酶标板上A、B两列分别加入标准品100uL，标准品设立2个复孔。在待测样品孔中加样品100μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0025](6)测定：酶标仪预热30分钟以上，调节波长为吸收光520nm，以甲苯调零，520nm依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加样后30分钟以内进行。
[0026](7)计算：根据标准品浓度和吸光度值，建立标准曲线。根据标准曲线的拟合方程，计算每个样品的脯氨酸含量，血浆的脯氨酸浓度是该值的10倍。
[0027]3.分析血浆脯氨酸诊断哮喘的效能(敏感度、特异度)
[0028]为了分析血浆脯氨酸对哮喘的诊断效果、敏感性和特异性，用SPSS 28.0软件做受
试者工作特征(ROC)曲线。
[0029](1)录入数据：新建Excel表格，表格第一列是健康人和哮喘的脯氨酸水平，第二列是健康人和哮喘患者的疾病状态，定义健康人状态为0，哮喘患者状态为1。
[0030](2)分析数据：用IBM SPSS 28.0软件打开表格，点击分析
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分类
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ROC曲线，选中疾病状态，在定义疾病状态中填1，检验变量是脯氨酸水平，点击分析可得到ROC曲线和曲线下面积；根据灵敏度和1
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特异度表格，计算灵敏度
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(1
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特异度)，这个值代表脯氨酸发现真正病人与非病人的总能力，此时脯氨酸水平就是诊断最佳截断值。
[0031]4.结果
[0032](1)哮喘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测脯氨酸的试剂在制备支气管哮喘辅助诊断试剂中的应用。2.提取及检测脯氨酸的试剂在制备支气管哮喘辅助诊断试剂中的应用。3.一种支气管哮喘辅助诊断试剂，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉宁飞，徐婷婷，袁琪，张希杰，吴晶晶，蒋静娴，王正霞，陈中琦，张明顺，黄茂，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：