糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒制造技术

本发明专利技术公开了糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒以四氧化三铁磁球为载体，在载体表面包裹一层二氧化硅，进一步修饰氨基和醛基，接着在醛基上连接抗原并用牛血清白蛋白对活性位点进行封闭，最后加入抗原的糖基化位点遮蔽剂进行阻断制备而成。所述磁性纳米颗粒可以实现抗体的特异性捕获或分离。本发明专利技术联合应用磁性纳米颗粒和以氧化石墨烯为载体的荧光信号放大器，不仅对抗体的检测灵敏度高，检测范围广，并且与酶联免疫吸附测定技术相比具有耗时短、制备简单、价格便宜、储存运输条件简单和稳定性好等优点。储存运输条件简单和稳定性好等优点。储存运输条件简单和稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，涉及糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒。

技术介绍

[0002]在许多疾病，如肿瘤、炎症和神经系统疾病的发展中，人类免疫系统能够通过产生相应的抗体来抵抗疾病。因此，特异性抗体可作为疾病进展的重要指标，抗体检测在疾病的诊断，特别是免疫性疾病和感染性疾病中起着至关重要的作用。此外，抗体类药物是近年来增长最快的生物制药之一。基于抗体的药物的定量检测对于临床评价给药效率、跟踪药物治疗的毒性、判断疾病的治疗效果具有重要意义。由于人体体液中富含多种抗体，且抗体的类型和数量与病理状况有关，因此检测体液中的特异性抗体具有重要意义。
[0003]近年来，酶联免疫吸附法、放射免疫法、电化学法和荧光免疫法已成为主要的抗体测定技术。但它们都存在一定的局限性，酶联免疫吸附法中酶标记抗体制备过程复杂、耗时，储存条件要求较高不便运输；放射免疫法中的放射性物质对实验环境要求较高，会出现交叉反应和假阳性反应；电化学法仪器价格昂贵、体积太大、检测芯片量太大，仍有待改进；荧光免疫法中荧光强度低、强背景引起的检测困难、生物结合引起的荧光猝灭等。因此，亟待需要研发高效便捷的抗体定量检测方法。
[0004]在糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒中，磁性纳米颗粒具有的磁性使其易于进行富集和分离，或进行定向移动定位，同时球形颗粒的磁性纳米粒子体积小、表面积大，固定目标分子效率高；磁性分离方法具有高效、简单、快速的优点；蛋白的糖基化位点被掩蔽剂阻断可以改善背景信号。掩蔽剂，例如4
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乙基苯硼酸、4
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甲基苯硼酸、4
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氟苯硼酸、4
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三氟甲基苯硼酸、4
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羟基苯硼酸、2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸、五氟苯硼酸。抗体的Fc片段中含有大量的碳水化合物链，可以被硼酸盐亲和材料特异性识别。由此，结合为公布号CN113512417A专利申请中提到的以氧化石墨烯为载体的荧光信号放大器对抗体进行定量检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术涉及一种创新的糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒作为抗体捕获材料对抗体进行特异性捕获。合成的抗体捕获材料是以四氧化三铁磁球为载体，首先在四氧化三铁表面包裹一层二氧化硅，然后修饰氨基再修饰醛基，接着在醛基上连接抗原并用牛血清白蛋白对活性位点进行封闭，最后加入抗原的糖基化位点遮蔽剂进行阻断。在应用方面，首先抗体由于其特异性的免疫亲和而被糖基化位点阻断/抗原固定化磁性纳米颗粒选择性捕获，然后加入公布号CN113512417A专利申请中提到的以氧化石墨烯为载体的荧光信号放大器，以氧化石墨烯为载体的荧光信号放大器上接枝的硼酸单体特异性识别抗体的Fc片段碳水化合物链，过量的以氧化石墨烯为载体的荧光信号放大器用磷酸盐缓冲液洗去；加入释放剂，使荧光物质从石墨烯表面释放，用荧光分光光度计测定荧光强度，即可实现抗体含量的定量检测。该方法进行抗体的超灵敏检测与酶联免疫吸附测定技术相比，价
格低廉、制备简单、稳定性高、储存条件简单且便于运输、检测灵敏度高，更容易推广使用。
[0006]具体的本专利技术采用了如下技术方案；
[0007]本专利技术第一方面提供了一种糖基化位点阻断/蛋白固定化的磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒为表面使用掩蔽剂阻断糖基化位点的磁性纳米颗粒。
[0008]在一些实施方案中，所述掩蔽剂为苯硼酸类化合物。
[0009]在一些实施方案中，所述苯硼酸类化合物选自4
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乙基苯硼酸、4
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甲基苯硼酸、4
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氟苯硼酸、4
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三氟甲基苯硼酸、4
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羟基苯硼酸、2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸或五氟苯硼酸。
[0010]在一些实施方案中，所述苯硼酸类化合物选自2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸或五氟苯硼酸。
[0011]在优选的实施方案中，所述苯硼酸类化合物为五氟苯硼酸。
[0012]在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒为二氧化硅层包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒。
[0013]在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒表面进行了氨基化修饰。
[0014]在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒表面进行了醛基化修饰。
[0015]在一些实施方案中，所述醛基连接在氨基上。
[0016]在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒表面连接有抗原。
[0017]在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒表面使用封闭剂钝化活性位点。可以使用本领域熟知的任何封闭剂来钝化活性位点，所述封闭剂包括但不限于脱脂奶粉、牛血清白蛋白、明胶或酪蛋白。
[0018]在本专利技术的具体实施方案中，所述封闭剂为牛血清白蛋白。
[0019]在本专利技术的具体的实施方案中，糖基化位点阻断/蛋白固定化的磁性纳米颗粒为以四氧化三铁为内核，二氧化硅层为外壳，外壳上连接有氨基和醛基，并固定了抗原和阻断了糖基化位点的磁性纳米颗粒。
[0020]本专利技术第二方面提供了一种糖基化位点阻断/蛋白固定化的磁性纳米颗粒的制备方法，包括：
[0021]1)制备二氧化硅层包裹的磁性纳米颗粒；
[0022]2)将二氧化硅层包裹的纳米颗粒进行氨基化修饰，制备氨基功能化的磁性纳米颗粒；
[0023]3)将氨基功能化的磁性纳米颗粒进行醛基化修饰，制备醛基功能化的磁性纳米颗粒；
[0024]4)将醛基功能化的磁性纳米颗粒分散在抗原溶液中，制备抗原固定的磁性纳米颗粒；
[0025]5)将抗原固定的磁性纳米颗粒分散在封闭剂溶液中，制备活性位点钝化的磁性纳米颗粒；
[0026]6)将活性位点钝化的磁性纳米颗粒分散到掩蔽剂溶液中，制备糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒。
[0027]在一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁磁性纳米颗粒。
[0028]在一些实施方案中，述掩蔽剂为苯硼酸类化合物。
[0029]在一些实施方案中，所述苯硼酸类化合物选自4
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乙基苯硼酸、4
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甲基苯硼酸、4
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氟苯硼酸、4
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三氟甲基苯硼酸、4
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羟基苯硼酸、2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸或五氟苯硼酸。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖基化位点阻断/蛋白固定化的磁性纳米颗粒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为表面使用掩蔽剂阻断糖基化位点的磁性纳米颗粒；优选地，所述掩蔽剂为苯硼酸类化合物；优选地，所述苯硼酸类化合物选自4
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乙基苯硼酸、4
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甲基苯硼酸、4
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氟苯硼酸、4
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三氟甲基苯硼酸、4
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羟基苯硼酸、2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸或五氟苯硼酸；优选地，所述苯硼酸类化合物选自2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸或五氟苯硼酸；优选地，所述苯硼酸类化合物为五氟苯硼酸；优选地，所述磁性纳米颗粒为二氧化硅层包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒；优选地，所述磁性纳米颗粒表面进行了氨基化修饰；优选地，所述磁性纳米颗粒表面进行了醛基化修饰；优选地，所述醛基连接在氨基上；优选地，所述磁性纳米颗粒表面连接有抗原；优选地，所述磁性纳米颗粒表面使用封闭剂钝化活性位点；优选地，所述封闭剂选自脱脂奶粉、血清白蛋白、明胶或酪蛋白；优选地，所述封闭剂为血清白蛋白。2.一种糖基化位点阻断/蛋白固定化的磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：1)制备二氧化硅层包裹的磁性纳米颗粒；2)将二氧化硅层包裹的纳米颗粒进行氨基化修饰，制备氨基功能化的磁性纳米颗粒；3)将氨基功能化的磁性纳米颗粒进行醛基化修饰，制备醛基功能化的磁性纳米颗粒；4)将醛基功能化的磁性纳米颗粒分散在抗原溶液中，制备抗原固定的磁性纳米颗粒；5)将抗原固定的磁性纳米颗粒分散在封闭剂溶液中，制备活性位点钝化的磁性纳米颗粒；6)将活性位点钝化的磁性纳米颗粒分散到掩蔽剂溶液中，制备糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒；优选地，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁磁性纳米颗粒；优选地，述掩蔽剂为苯硼酸类化合物；优选地，所述苯硼酸类化合物选自4
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乙基苯硼酸、4
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甲基苯硼酸、4
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氟苯硼酸、4
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三氟甲基苯硼酸、4
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羟基苯硼酸、2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸或五氟苯硼酸；优选地，所述苯硼酸类化合物选自2,3
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二氟苯硼酸、3,5
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二氟苯硼酸、3,4,5
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三氟苯硼酸、2,3,5,6
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四氟苯硼酸或五氟苯硼酸；优选地，所述苯硼酸类化合物为五氟苯硼酸；优选地，糖基化位点阻断/蛋白固定化磁性纳米颗粒的质量百分数如下：活性位点钝化的磁性纳米颗粒：78.00
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86.00％掩蔽剂：0.09
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0.32％磷酸二氢钠：0.37
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0.75％磷酸氢二钠：0.73
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1.50％
双蒸水：8.60
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17.50％。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)制备二氧化硅层包裹的磁性纳米颗粒方法如下：按计量将磁性纳米颗粒分散在无水乙醇中，随后加入双蒸水和氨水，混合均匀后加入四乙氧基硅烷反应，反应完成后进行洗涤，干燥得到二氧化硅层包裹的磁性纳米颗粒；优选地，反应采用超声3
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5h；优选地，洗涤采用无水乙醇和双蒸水交替洗涤；优选地，干燥采用烘箱减压干...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涎桦，董林毅，白晨晨，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：