一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法技术

本发明专利技术提供一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法，该方法是利用饱和ＫＯＨ－ＣＨ３ＯＨ对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用ＨＣｌ－ＣＨ↓［３］ＯＨ进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下：（１）样品准备，（２）脂肪酸的提取、皂化和甲酯化，（３）脂肪酸的气相色谱检测条件。该方法具有操作步骤简单，节省时间，方法简单快捷，数据直观，增加了样品之间的可比性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋微生物领域，具体地说，其是对海洋微藻脂肪酸利用饱和 KOH-CH3OH快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法。
技术介绍
海洋微藻含有丰富的脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFAs)、蛋白质、各种维生素、生 物多糖等，具有优异的营养保健功能。开发和利用微藻资源已成为当今世界生命科学 与
关注的焦点之一。研究证实，多不饱和脂肪酸对于生物体具有重要转化成具调节某些生理功能的代 谢产物等。y—亚麻酸(y-linolenicacid)、 AA、 二十碳五烯酸 和二十二碳六烯酸是比较重要的PUFAs，其中EPA和DHA作为人体 必须脂肪酸，在营养强化、预防和治疗多种疾病如预防动脉粥样硬化和心血管疾病， 降低血浆中胆固醇和甘油三酯水平、减轻炎症等有明显疗效。此外，已有关于EPA作 为抗癌剂的报道。海洋微藻是海洋生态体系中重要的初级生产者，某些海洋微藻不仅含有较高的脂肪 酸和多不饱和脂肪酸，而且其组成比较单一，利于分离纯化。海洋微藻具有资源丰富、 生长快等优点，在保健品和生物能源方面具有较大开发和利用的潜力，已经成为国内外 的研究热点。对海洋微藻脂肪酸的测定，目前还没有标准方法，大多数的方法是用有机溶剂提取 浓縮后得到微藻粗脂肪，粗脂肪加热皂化两个小时后用有机溶剂提取浓縮，再经过一 个小时甲酯化，用有机溶剂提取，利用GC来测定脂肪酸的含量。蒋霞敏等采用Bligh-Dyer法提取微藻中总脂。提取总脂加KOH甲醇溶液皂化2h。皂化液转移到离心管中，用盐酸调，加饱和氯化钠溶液，用氯仿正己烷提取两次。合并 提取液，浓縮，浓縮液再甲酯化lh，最后用正己垸提取，上气相色谱仪进行分析。该方 法操作复杂，处理时间长，步骤繁琐。Chiara Bigogno的方法是在藻粉加入H2S04/甲醇溶液，将样品瓶放入80 。C砂浴(磁力加热板)中加热搅拌抽提lh 。再用正己烷萃取，离心15min。取出上层正己垸层氮气下吹干，再加入100 nL正己垸备测。与其它方法比较，该方法操作步骤虽然已经简化，但还是比较繁琐，操作时间较长，所以不适合在实验室快速检测。针对微藻脂肪酸，如何建立快速，简便、准确的检测方法，是今后一段时期功能食品研究开发的热点。本文即针对这一问题，开展微藻脂肪酸快速测定方法研究，并利用该方法探讨从微藻中提取脂肪酸的最近试验条件，为其应用提供前期基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该方法利用饱和 K0H-CH30H对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用HC1-CH30H 进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析， 本方法与传统常用的微藻脂肪酸提取制备方法比较，具有操作步骤简单、节省时间、 有机试剂用量少、减少了有机溶剂的使用量，节约了人力物力，大大提高了工作效率。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法。该方法利用饱和KOH-CH30H对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用HC1-CH30H进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下(1) 样品准备称取8-10mg的藻粉样品；配制饱和K0H—CH30H溶液和l moL / L的HC1"CH30H溶液(使 PH< 2);取15.00 mg十九碳酸于10 niL容量瓶中，用正己垸稀释至刻度配制成内标溶液； 将混合标准溶液用正己垸稀释至100倍成标准溶液；(2) 脂肪酸的提取、皂化和甲酯化该方法利用饱和K0H-CH30H对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合 二为一，再用HC1-CH30H进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化 后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下1、 脂肪酸提取条件的确定脂肪酸测定方法称取10mg左右的藻粉样品，置于螺口试管中，加50化浓度为lmg/mL 的十九碳酸内标和lmL的饱和K0tMH30H溶液，充氨气保护，于75"C水浴皂化10 min，冷 却后加2 mL的l moL/L的HCl—CH30H溶液(使pH〈 2).混匀.75。C水浴10 min。冷却.加 0.5 mL正己烷和2 mL蒸馏水，充分振荡，静置，取正己烷层，用气相色谱质谱仪分析。 标准曲线的绘制内标溶液准确称取15.00 mg十九碳酸于10 mL容量瓶中，用正己烷稀释至刻度。 标准溶液将混合标准溶液用正己烷稀释至100倍。2、 样品的测定和计算标准溶液的测定取标准溶液l叱注入气相色谱仪，得到标准溶液的谱图，经计算 得到各脂肪酸的校正因子。样品的测定取l化待测样品注入气相色谱仪进行测定，根据标准溶液的谱图进行定性，根据校正因子进行定量。游离脂肪酸含量的计算根据被测物和内标物的质量及在色谱图上相应的峰面积比， 由校正因子按下式求游离脂肪酸的含量Xi= WsxFsi xAi / (AsxWi)。其中，Xi为微藻脂肪酸i的含量；Ws为样品中加入内标物的质量；As为内标物的峰面 积；Ai为脂肪酸i的峰面积，Fsi为相对校正因子，计算公式如下 Fsi=WixAs/ (WsxAi)。3、 色谱条件5将藻粉样品置于螺口试管中一加50叱浓度为lmg/mL的十九碳酸内标和lmL的饱 和KOH—CH3OH溶液一充氨气保护一于75'C水浴皂化10 min—冷却后加2 mL的1 moL / L的HC]-CH30H溶液(使PH< 2)混匀一75。C水浴10 min—冷却一加0. 5 mL正己垸和 2 mL蒸馏水一振荡一静置一取正己垸层用气相色谱质谱仪分析； (3)脂肪酸的气相色谱检测条件a、 色谱柱HP-5MS石英毛细管柱(30mX0.25mmidX0.25um);b、 载气氦气，流速为lmL/min，进样口温度25(TC，传输线温度为30(TC;c、 电子能量70 eV，离子源温度230 °C,四极杆温度150 TT ;d、 升温程序为初温50。C ， 1(TC/min升到280°C;e、 进样量lpL，分流进样(10: 1)，扫描方式为全扫描(Scan)方式； 各脂肪酸组分含量由对应的峰面积和内标物的峰面积的比值求得。本专利技术快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法优点是本方法的与传统常用的微藻脂肪酸提取制备方法比较，具有操作步骤简单(两步即可完成，传统方法需要至少需要五步)、节省时间(整个操作过程只需30min，传统方法需要3-4h)，有机试剂用量少(每一个样品只需2ml即可)等优点，减少了有机溶剂的使用量，节约了人力物力，这样大大提高了工作效率。传统的脂肪酸计算方法是采用面积归一化法计算相对百分含量，计算的数据是一个相对值，数据之间可比性比较差，本专利技术的方法采用内标法进行定量分析，方法简单快捷，数据直观，增加了样品之间的可比性。为微藻的开发利用提供了科学可靠的基础数据。附图说明图1为脂肪酸气相色谱分离图； 具体实施例本专利技术的保护范围不仅局限于以下实施例中，参见图1本专利技术的具体技术步骤如下色谱柱HP-5MS石英毛细管柱(30mX0. 25mm idX0.25um);载气氦气，流 速为lmL/min，进样口温度250°C，传输线温度为300°C。电子能量70 eV，离子源温 度230 °C，四极杆温度150 。C 。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量的方法，其特征在于：利用饱和ＫＯＨ－ＣＨ３ＯＨ对微藻中脂类提取并造化，使提取过程和造化过程合二为一，再用ＨＣｌ－ＣＨ３ＯＨ进行甲酯化，获得脂肪酸，该组分经过提取、皂化和甲酯化后进行气相色谱质谱分析，具体步骤如下：　（１）样品准备：　称取８－１０ｍｇ的藻粉样品；配制饱和ＫＯＨ－ＣＨ↓［３］ＯＨ溶液和１ｍｏＬ／Ｌ的ＨＣｌ－ＣＨ↓［３］ＯＨ溶液（使ｐＨ＜２）；取１５．００ｍｇ十九碳酸于１０ｍＬ容量瓶中，用正己烷稀释至刻度配制成内标溶液；将混 合标准溶液用正己烷稀释至１００倍成标准溶液；　（２）脂肪酸的提取、皂化和甲酯化：　将藻粉样品置于螺口试管中→加５０μＬ浓度为１ｍｇ／ｍＬ的十九碳酸内标和１ｍＬ的饱和ＫＯＨ－ＣＨ↓［３］ＯＨ溶液→充氨气保护→于７５℃水浴皂化１０ｍ ｉｎ→冷却后加２ｍＬ的１ｍｏＬ／Ｌ的ＨＣｌ－ＣＨ↓［３］ＯＨ溶液（使ｐＨ＜２）混匀→７５℃水浴１０ｍｉｎ→冷却→加０．５ｍＬ正己烷和２ｍＬ蒸馏水→振荡→静置→取正己烷层用气相色谱质谱仪分析；　（３）脂肪酸的气相色谱检测条件：　ａ 、色谱柱：ＨＰ－５ＭＳ石英毛细管柱（３０ｍ×０．２５ｍｍ　ｉｄ×０．２５ｕｍ）；　ｂ、载气：氦气，流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，进样口温度２５０℃，传输线温度为３００℃；　ｃ、电子能量７０ｅＶ，离子源温度２３０℃，四极杆温度１５０℃’； 　ｄ、升温程序为：初温５０℃，１０℃／ｍｉｎ升到２８０℃；　ｅ、进样量１μＬ，分流进样（１０∶１），扫描方式为全扫描（Ｓｃａｎ）方式；　各脂肪酸组分含量由对应的峰面积和内标物的峰面积的比值求得。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨佰娟，郑立，韩笑天，刘涛，
申请(专利权)人：国家海洋局第一海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]