本发明专利技术涉及一种检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，包括以下步骤：选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；制备糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液；制备纳米材料溶液；将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上。将按上述方法制得的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极连接到电化学工作站，可对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。本发明专利技术的制备方法具有可控性，提高了电极的灵敏度和准确性；所制备的分子印迹膜电极对细菌毒素具有高特异性、高灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法， 及采用所述的糖基功能化分子印迹膜电极检测环境样本中痕量细菌毒素的方法，属于环 境污染物检测
技术介绍
细菌毒素主要有三种外毒素、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性 蛋白，是细菌在指数生长期分泌的已知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时 就具有很高的毒性。目前细菌毒素已成为迫切需要治理的新一代环境污染物，微量的细 菌毒素即可对正常激素作用产生影响，干扰内分泌机能，引起哺乳动物及人类的生殖障 碍、发育异常及某些病理性损伤。这类物质不仅存在于工业废水、废气和生活污水中， 在农产品中也可能存在。如果细菌毒素残留不能得到及时、准确地检测，它们就可能进 入机体，并在体内直接或间接影响正常的激素代谢，给人类健康带来严重的危害。建立一种高灵敏度和特异性的快速筛检细菌毒素残留的方法，便成为当前该研究领 域亟需解决的问题之一。细菌毒素的检测分析方法主要有生物学方法，如动物测毒法 和细胞测毒法；免疫学方法，如有反向被动血凝实验(RPHA)、被动免疫溶血试验(PIH)、 毒素与抗毒素琼脂扩散试验、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA);分子生物学方法，如PCR法。这些检测方法虽然灵敏度较高，稳定性较好，但大多都有周期长，过程复杂，费时费力结果准确性低等缺点。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测速度快、灵敏度高的 检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法
本专利技术的另一目的是提供采用上述糖基功能化分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的所述的检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，其特征在 于包括以下步骤(1) 选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；(2) 将模板分子细菌毒素、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按一定摩尔 比混合均匀，制成糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液；(3) 选取纳米材料，按照现有方法制备出纳米材料溶液；(4) 利用电极表面修饰技术，将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到 传感器电极表面上。所述模板分子细菌毒素、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的摩尔比为o.i 2 : 2.5: o.i 5 : 40 80 : o.oi o.io : i.o i5。所述功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神 经节苷脂或祌经酰胺三己糖苷；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、 氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、杂环化合物酰胺或砜类；所述有机溶剂为二氯 甲烷或四氯化碳。所述纳米材料溶液为碳纳米管溶液、纳米金溶液或纳米铂溶液。本专利技术所述将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极 表面包括以下步骤(1) 将工作电极表面用0.05 (im的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再依次用1 mol/LHN03， lmol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干；(2) 将制备的纳米材料溶液超声处理20-60min，得到分散的纳米溶液；(3) 将工作电极表面浸泡于分散的纳米溶液中5-10分钟，取出晾干；(4) 将步骤(3)中晾干的工作电极再浸泡于糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液中 5-10分钟，然后取出用洗脱剂洗脱20-30分钟，直至去除表面的模板分子，再于室温下 干燥5-10分钟；所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸或乙腈-乙酸；(5) 重复步骤(3)和歩骤(4)过程4-7次，制得所述糖基功能化细菌毒素分子印迹膜龟 极。为除去电极表面过量的糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物，可将制得的糖基功能 化分子印迹膜电极浸入pH6.8-7.5缓冲液中，保存在4'C冰箱，12 24h后取出，用去离 子水彻底清洗，即可使用。所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。本专利技术所述的采用上述糖基功能化分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法，包括以下 步骤将按上述方法制得的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极连接到电化学工作站， 对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。本专利技术的有益效果.-1. 糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极制备方法，将纳米材料的纳米增效作用引 入到糖基功能化分子印迹膜电极的制备当中，使得所制备的糖基功能化细菌毒素分子印 迹膜电极具有更高的灵敏性和检测范围。2. 将表面修饰技术应用到糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备当中，使得 纳米增效的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备具有可控性，提高了电极的灵敏 度和准确性。3. 本专利技术所得到的纳米增效的痕量糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极，可以实 现对样本中细菌毒素的高特异性、高灵敏度、快速检测。4. 本专利技术的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的特异性强，样品中其它非特异 性分子对检测结果无影响；灵敏度高，可以达到ng级；检测速度快，完成一个基本检 测过程仅需l-2分钟的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选；成本低，检测 l个样品仅需几分钱。5. 糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法，操作快速简单，反 应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性， 便于现场检测。附图说明图1为纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面过程 示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。 实施例1一种检测白喉毒素的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤-(1) 选择能与白喉毒素合成糖基功能化MIPs的功能单体A-D-吡喃糖基甘露糖；(2) 碳纳米管溶液制备在超声搅拌的条件下，将2mg多壁碳纳米管 (Multi-walled carbon nanotubes， MWCNTs)力B入到1 ml二甲基亚砜、溶液中，从而获得黑色悬浊液即MWCNTs溶液；(3) 取制备好的MWCNTs溶液20nl，超声30 min，得到均匀分散的MWCNTs 溶液；(4) 模板分子白喉毒素，功能单体A-D-吡喃糖基甘露糖，交联剂乙二醇二甲 基丙烯酸酯(EGDMA)，致孔剂氯仿，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比为o.i : 2.5 : 0.5 : 70 : 0.05 : 2.0的比例混合均匀，得到白喉毒素糖基功能化MIPs溶液；(5) 工作电极选用玻璃碳电极，将工作电极表面用0.05 pm的氧化铝粉打磨， 超声波清洗，再分别用1 mol/LHN03， 1 mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清 洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；(6) 如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在分散的MWCNTs溶液中5分钟，然 后将电极取出在室温下干燥10 min，再将玻璃碳电极浸泡在白喉毒素糖基功能化 分子印迹聚合物溶液中5分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱工作 电极表面20分钟，直至把这一层中的模板分子白喉毒素分子完全洗掉，在室温下 干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在MWCNTs溶液中5分钟，然后将电极取出在 室温下干燥10min，再将电极浸泡在白喉毒素糖基功能化MIPs溶液中5分钟，然 后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤： （１）选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体； （２）将细菌毒素的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按一定摩尔比混合均匀，制成糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液； （３）选取纳米材料，按照现有方法制备出纳米材料溶液； （４）利用电极表面修饰技术，将纳米材料和糖基功能化分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，裴梅山，于京华，汪世华，葛慎光，朱晗，林青，张秀明，邢宪荣，贺晓蕊，孙纳新，宋晓妍，袁靓，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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