一种几丁质酶突变体ChiTgM及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程以及酶工程领域，具体涉及一种几丁质酶突变体ChiTgM及其应用。本发明专利技术通过基因克隆获得几丁质酶ChiTg，通过密码子优化实现了其在毕赤酵母中的异源表达，通过定点突变、组合突变获得几丁质酶突变体ChiTgM。通过对几丁质酶ChiTg和突变体ChiTgM的酶学特性进行分析，相比于出发模板ChiTg，本发明专利技术提供的几丁质酶突变体ChiTgM的酶比活提升了1.81倍，并且显示良好的水解特性，将其应用于酶法制备几丁质寡糖，能够高效水解胶体几丁质，为其下一步产业化应用奠定基础。为其下一步产业化应用奠定基础。为其下一步产业化应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质酶突变体ChiTgM及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程以及酶工程领域，具体涉及一种几丁质酶突变体ChiTgM及其应用。

技术介绍

[0002]几丁质寡糖作为几丁质的水解产物，研究表明其可以作为一种生物刺激素应用于农业种植领域。已报道的研究证实几丁质寡糖在多个方面发挥重要作用：(1)通过提高农作物免疫力，从而提升其抗病虫害的能力；(2)调控激活农作物生长因子，达到增产增收的效果；(3)降低农药化肥的使用量，促进绿色农业种植。目前几丁质寡糖的制备主要以化学法为主，通过强酸将几丁质降解成几丁质寡糖，此种工艺具有副产物多，终产物结构不完整、污染环境等缺点。因此需要开发一种更绿色环保的方法用于几丁质寡糖的制备。
[0003]几丁质酶作为几丁质分解的特异酶，通过水解几丁质内部的糖苷键，从而形成不同聚合度的几丁质寡糖。根据已报道的文献，目前几丁质酶存在催化活性低、生产成本高等缺点。因此开发筛选高效的几丁质酶具有重要意义。
[0004]本专利通过基因克隆获得盖姆斯木霉几丁质酶ChiTg，通过密码子优化实现其在毕赤酵母异源表达，通过定点突变和组合突变获得酶比活提升的突变体ChiTgM，此外分析了几丁质酶ChiTg和突变体ChiTgM的酶学特性，并将突变体ChiTgM应用于酶法制备几丁质寡糖。本专利结果表明突变体ChiTgM能够高效水解胶体几丁质，为其下一步产业化应用奠定基础。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种几丁质酶突变体ChiTgM及其应用。本专利技术基于同源RT
‑
PCR获得几丁质酶ChiTg编码基因chitg；根据毕赤酵母密码子偏好性优化获得不含几丁质酶ChiTg自身信号肽编码基因chitgs；基于同源建模获得几丁质酶ChiTg三维构象，通过分子对接分析获得几丁质酶ChiTg催化活性区域关键氨基酸；通过定点突变和组合突变获得酶催化活性提升的几丁质酶突变体ChiTgM。与几丁质酶ChiTg酶比活相比，本专利技术获得的几丁质酶突变体ChiTgM(酶比活为51.2U/mg)，是几丁质酶ChiTg(酶比活为28.3U/mg)的1.81倍。本专利技术获得的几丁质酶突变体ChiTgM可以高效水解胶体几丁质制备几丁质寡糖，为其下一步产业化应用奠定了基础。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种几丁质酶突变体ChiTgM，所述几丁质酶突变体ChiTgM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]SPVAASNVSVEKRASGYANAVYFTNWGIYGRNFQPQNLVASDITHVIYSFMNFQADGTVVSGRAYADYQKHYDDDSWNDVGNNAYGCVKQLFKLKKANRNLKVMLSIGGWTWSTNFPSAASTDANRKNFAKTAITFMKDWGFDGIDVDWEYPADDTQATNMVLLLKEIRSQLDAYAAQYAPGYHFLLSIAAPARPEHYSFLHMSDLGQVLDYVNLMAYDYAGKWSSYSGHDANLFANPSNPNSSPYNTDQAIKDYIKGGVPASKIVLGMPIYGRSFESTGGIGQTYSGIGSGSWER
GIWDYKVLPKAGATVQYDSVAQAYYSYDPSSKELISFDTPDMINTKVSHLKNDGLTGSMFWKAFANKTGKDSLIGTSHRALGSLDSTQNLLSYPNSQKDFIRNGLN(SEQ ID NO.1)
[0009]优选的，编码所述几丁质酶突变体ChiTgM氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]TCTCCAGTTGCGGCTTCCAACGTTTCCGTTGAAAAGAGAGCTTCTGGTTACGCCAACGCCGTTTACTTCACTAACTGGGGTATCTACGGTAGAAACTTCCAGCCTCAGAACTTGGTTGCCTCCGACATTACCCACGTCATCTACAGCTTCATGAACTTCCAAGCCGACGGTACTGTTGTTTCTGGTCGGGCTTACGCCGACTACCAAAAGCACTACGATGATGACTCTTGGAACGACGTTGGTAACAACGCCTACGGTTGTGTCAAGCAGTTGTTCAAGTTGAAGAAGGCCAACAGAAACCTGAAGGTCATGTTGTCCATTGGTGGTTGGACTTGGTCCACTAACTTTCCATCTGCTGCTTCCACTGACGCTAACAGAAAGAACTTCGCTAAGACCGCCATCACTTTCATGAAGGATTGGGGTTTCGACGGTATCGACGTTGATTGGGAATACCCAGCTGATGACACTCAGGCTACCAACATGGTCTTGCTGTTGAAAGAGATCAGATCCCAGTTGGACGCTTACGCTGCTCAATACGCTCCAGGTTACCACTTCTTGTTGTCTATTGCTGCTCCAGCTAGGCCAGAGCACTACTCTTTCTTGCACATGTCTGACTTGGGTCAAGTCCTGGACTACGTTAACTTGATGGCTTACGACTACGCTGGTAAGTGGTCCTCTTACTCTGGTCACGATGCTAACTTGTTCGCTAACCCATCTAACCCAAACTCTTCCCCATACAACACTGACCAGGCTATCAAGGACTACATCAAAGGTGGTGTTCCAGCTTCCAAGATCGTCTTGGGTATGCCAATCTACGGAAGATCCTTCGAATCCACTGGTGGTATCGGTCAAACTTACTCCGGTATTGGTTCTGGTTCCTGGGAGAGGGGTATTTGGGACTACAAGGTTTTGCCAAAGGCTGGTGCTACTGTTCAGTACGACTCTGTTGCTCAAGCCTACTACTCTTACGACCCATCCTCCAAAGAGCTGATCTCCTTCGATACTCCAGACATGATCAACACCAAGGTGTCCCACCTGAAGAACGACGGTCTTACGGGTTCTATGTTCTGGAAGGCTTTCGCTAACAAGACTGGTAAGGACTCCTTGATTGGTACTTCCCATAGAGCTTTGGGTTCCTTGGACTCTACCCAGAACTTGCTGTCTTACCCTAACAGCCAGAAGGACTTCATCAGAAACGGTTTGAACTAA(SEQ ID NO.2)
[0011]本专利技术的第二个目的是提供一种重组表达载体pPICZαA
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chitgm，包含上述所述的多聚核苷酸序列。
[0012]本专利技术的第三个目的是提供一种重组菌，包含如上述所述的重组表达载体pPICZαA
‑
chitgm。
[0013]优选的，所述重组菌以毕赤酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质酶突变体ChiTgM，其特征在于，所述几丁质酶突变体ChiTgM的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的几丁质酶突变体ChiTgM，其特征在于，编码所述几丁质酶突变体ChiTgM氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种重组表达载体pPICZαA
‑
chitgm，其特征在于，包含权利要求2所述的多聚核苷酸序列。4.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建荣，祝木金，王平，陈微，钟斌，陈孟林，高美芳，曹革，
申请(专利权)人：深圳润康生态环境股份有限公司，
类型：发明
国别省市：