内切葡聚糖酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌体和酶制剂以及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及可再生能源和生物工程技术，公开了一种内切葡聚糖酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌体和酶制剂以及它们的应用。所述内切葡聚糖酶突变体为：具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；或者SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第12位和第264位经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有内切葡聚糖酶突变体活性的氨基酸序列所示的酶；或者在所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；或者在所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。该内切葡聚糖酶突变体的乙醇抗性、有机溶剂抗性显著提高，催化效率高，提高生物乙醇的生产效率。醇的生产效率。醇的生产效率。

【技术实现步骤摘要】
内切葡聚糖酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌体和酶制剂以及它们的应用


[0001]本专利技术涉及可再生能源和生物工程技术，具体地，涉及一种内切葡聚糖酶突变体，一种内切葡聚糖酶突变体的编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种内切葡聚糖酶突变体的制备方法，一种酶制剂以及它们在降解纤维素和/或制备生物乙醇中的应用。

技术介绍

[0002]生物乙醇是最具应用前途的可持续可再生资源之一，其大规模生产有可能解决目前世界上的环境和能源挑战。由于以含糖和含淀粉的原料生产第一代乙醇可能会导致食品供应短缺，而木质纤维素生物质作为地球上最丰富的可持续碳源，如果能够有效地转化为乙醇，将存在很大的发展潜力。木质纤维素生物质的主要成分是高分子碳水化合物纤维素、半纤维素和木质素，它们可以通过化学或酶法水解成单糖，产生葡萄糖。由于酶法水解在温和的条件下进行，消耗的能量较少，属于更具实用性的生物质水解机制。稳定的纤维素酶在工业生物乙醇发酵中起着关键的作用，有利于减少酶的用量，克服高固体、抑制剂和糖浓度形成的限制。然而，现有的纤维素酶在生物乙醇生产中容易受到乙醇浓度或其它抑制剂的抑制作用，导致活性大大降低甚至失活，降低了发酵效率，干扰了生物乙醇的经济效益。
[0003]纤维素酶属于糖苷水解酶，在相对较低的温度下将(半)纤维素水解为葡萄糖单体，纤维素的完全降解需要三种不同类型的纤维素酶的协同作用：内切葡聚糖酶(EG)在纤维素中形成间隙，打开还原端和非还原端；纤维素水解酶(CBH)作用于还原端和非还原端以释放纤维素，β
‑
葡萄糖苷酶(BGL)切断纤维素以释放葡萄糖。内切葡聚糖酶是水解木质纤维素必不可少的关键酶，然而，在生物乙醇生产过程中，乙醇浓度的增加对内切葡聚糖酶的活性均形成明显的抑制作用，进而降低生物乙醇的生产效率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了克服在生物乙醇生产过程中乙醇抑制内切葡聚糖酶活性的问题，提供一种内切葡聚糖酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌体和酶制剂以及它们的应用，该内切葡聚糖酶突变体的乙醇抗性、有机溶剂抗性显著提高，催化效率高，提高生物乙醇的生产效率。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种内切葡聚糖酶突变体，所述内切葡聚糖酶突变体为(a)
‑
(d)中任意一项所述的酶：
[0006](a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；
[0007](b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第12位和第264位经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有内切葡聚糖酶突变体活性的氨基酸序列所示的酶；
[0008](c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
[0009](d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的
酶。
[0010]优选地，所述内切葡聚糖酶突变体为具有SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶。
[0011]本专利技术第二方面提供一种编码内切葡聚糖酶突变体的基因，该基因具有编码前述的内切葡聚糖酶突变体的核苷酸序列。
[0012]优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
[0013]更优选地，所述基因具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0014]优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
[0015]更优选地，所述基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0016]本专利技术第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有前述的基因。
[0017]优选地，所述重组载体的表达载体选自pBSYA1S1Z质粒、pET22b质粒和pET28a质粒中的至少一种；更优选为pBSYA1S1Z质粒。
[0018]本专利技术第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有前述的基因或者前述的重组载体。
[0019]优选地，所述重组菌株选自毕赤酵母、大肠杆菌和酿酒酵母中的至少一种；更优选为毕赤酵母BSYBG11。
[0020]本专利技术第五方面提供一种内切葡聚糖酶突变体的制备方法，该制备方法包括：将前述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵得到发酵液，对所述发酵液进行分离纯化，得到内切葡聚糖酶突变体。
[0021]本专利技术第六方面提供一种酶制剂，该酶制剂包含前述的方法制备得到的内切葡聚糖酶突变体。
[0022]本专利技术第七方面提供前述的内切葡聚糖酶突变体、前述的基因、前述的重组载体、前述的重组菌株、前述的方法制备得到的内切葡聚糖酶突变体和前述的酶制剂中的至少一种在降解纤维素和/或制备生物乙醇中的应用。
[0023]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0024]本专利技术采用KnowVolution定向进化技术结合建立的高通量筛选方案，对内切葡聚糖酶进行改造，筛选得到具有乙醇抗性、有机溶剂抗性的内切葡聚糖酶突变体，此外，该内切葡聚糖酶突变体的催化效率明显提高，应用于木质纤维素生物质生产生物乙醇的过程中，能够有效提高对木质纤维素生物质原料的利用率，显著提高生物乙醇的产率和产量，降低生物乙醇的生产成本。
[0025]本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0026]图1是实施例1中EG变体和野生型EG纯化后的蛋白凝胶图，WT为野生型EG、1为EG变体S12K/T77M/E85Y/G264H、2为EG变体S12C/T77M/E85Y/G264R；
[0027]图2是实施例1中EG变体和野生型EG在不同有机溶剂中的乙醇抗性图。
具体实施方式
[0028]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或
值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0029]本专利技术第一方面提供一种内切葡聚糖酶突变体，所述内切葡聚糖酶突变体为(a)
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(d)中任意一项所述的酶：
[0030](a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；
[0031](b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第12位和第264位经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有内切葡聚糖酶突变体活性的氨基酸序列所示的酶；
[0032](c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
[0033](d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
[0034]本专利技术的专利技术人在研究过程中，将蛋白质工程与定向进化和合理设计相结合，对具有SEQ IDNO.5所示氨基酸序列的内切本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内切葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述内切葡聚糖酶突变体为(a)
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(d)中任意一项所述的酶：(a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；(b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第12位和第264位经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有内切葡聚糖酶突变体活性的氨基酸序列所示的酶；(c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；(d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。2.根据权利要求1所述的内切葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述内切葡聚糖酶突变体为具有SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶。3.一种编码内切葡聚糖酶突变体的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1或2所述的内切葡聚糖酶突变体的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列；更优选地，所述基因具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。5.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，乔杰，盛义杰，李秀娟，王明慧，李安妮，魏珺楠，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：