一种突变的几丁质酶SsChi18A-2及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种几丁质酶SsChi18A的突变基因SsChi18A

【技术实现步骤摘要】
一种突变的几丁质酶SsChi18A
‑
2及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种突变的几丁质酶SsChi18A
‑
2及其应用。

技术介绍

[0002]几丁质是一种多聚
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β
‑
1,4
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖(NAG)，是自然界中除纤维素外含量第二丰富的多糖。几丁质主要来源于甲壳类动物，每年水体中产生的几丁质高达10
11
吨。生物质中的几丁质去矿化并除蛋白以获取纯甲壳素的过程常用浓酸或碱来进行的，但会造成腐蚀及产生环境问题。酶法降解几丁质能够产生多种药理活性成分，例如N
‑
乙酰葡糖胺(NAG)和几丁质寡糖(CHOS)，可以作为药物输送载体和抗氧化剂，在抗肿瘤、伤口愈合、控制血液胆固醇和食品保存方面发挥作用。几丁质酶的来源广泛，酶解过程环境友好，在工业生产中应用潜力巨大。目前，几丁质酶制剂广泛应用在医药、食品、生物技术、植物病虫害防治等众多领域。
[0003]几丁质是仅次于纤维素的自然界中最丰富的天然多糖，分别由β
‑
N
‑
1,4
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葡萄糖和β
‑
N
‑
1,4
‑
氨基葡萄糖聚合而成。这些多糖具有高度结晶性，通过分子内和分子间复杂的氢键网络形成抗降解屏障，使其降解成为难题。但是生物体进化出高效利用结晶多糖的复杂机制，利用环境导向的糖苷水解酶协同作用将顽固多糖水解为可溶性多糖，特别是一些具有益生元价值的可溶性寡糖，在工业、农业及医疗领域具有重要应用价值。
[0004]Streptomyces sp.F
‑
3是专利技术人课题组在高温生境分离筛选到的一株嗜热放线菌，该菌最适生长温度为50℃。全基因组测序分析结果显示，该菌含有9个几丁质降解相关酶，包含一个外切持续性几丁质酶SsChi18A。丰富的几丁质降解酶及嗜热特征使其具有发展成为几丁质高效降解工业菌的潜力。
[0005]SsChi18A的实际应用中，仍存在着亟待解决的问题；缩短工艺流程，提高生产效益亟待具有更高活性几丁质酶的出现。为了扩展SsChi18A的工业应用，提高其酶活性是一个很关键的任务。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种突变的几丁质酶及其应用。
[0007]本专利技术中，突变的几丁质酶命名为SsChi18A
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2，也可以称之为SsChi18A
‑
E287A，或者以E287A来指代。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种突变的几丁质酶，所述突变的几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]另一方面，本专利技术还提供了所述突变的几丁质酶的编码基因；优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]另一方面，本专利技术还提供了包含所述突变的几丁质酶的编码基因的重组载体；优选的，所述重组载体为重组表达载体；优选为pET系列的载体，例如，pET
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15b、pET
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22b、pET
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28a。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选的，所述重组菌株为大肠杆菌，如，大肠杆菌BL21。
[0012]另一方面，本专利技术还提供了所述突变的几丁质酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株在降解含有几丁质的材料中的应用。应当理解，含有几丁质的材料包括天然含有几丁质的材料，或者经加工的含有几丁质的材料；此外，几丁质单体也属于含有几丁质的材料的概念。
[0013]在一个实施方式中，含有几丁质的材料为来自真菌的菌渣，例如，出芽短梗霉的菌渣。
[0014]在一个实施方式中，所述出芽短梗霉菌渣是利用出芽短梗霉发酵生产特定产物后剩余的菌渣。
[0015]另一方面，本专利技术还提供了所述突变的几丁质酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株在制备几丁质寡糖中的应用。
[0016]另一方面，本专利技术还提供了一种降解含有几丁质或者含有几丁质寡糖的材料的方法，所述方法包括利用所述突变的几丁质酶、所述编码基因、所述重组载体或重组菌株对含有几丁质或者含有几丁质寡糖的材料进行处理的步骤。应当理解，含有几丁质的材料包括天然含有几丁质的材料，或者经加工的含有几丁质的材料；此外，几丁质单体也属于含有几丁质的材料的概念。含有几丁质寡糖的材料包括天然含有几丁质寡糖的材料，或者经加工的含有几丁质寡糖的材料；此外，单纯的几丁质寡糖也属于含有几丁质寡糖的材料的概念。
[0017]优选的，所述寡糖为二糖、三糖、四糖、五糖或六糖。
[0018]进一步的，所述处理的温度为30℃
‑
80℃，优选，50℃
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70℃；所述处理的pH为3
‑
11，优选，4
‑
7。
[0019]本专利技术具有的有益效果是：
[0020]本专利技术公开的几丁质酶SsChi18A的突变体SsChi18A
‑
2的活性比野生型酶提高了35％，并且在降解真菌细胞壁时酶活较野生型提高49％，这些结果表明突变体在降解几丁质类底物方面有着广泛的应用。在作为医药、食品、生物技术、植物病虫害防治等工业用酶时，能在更广泛的环境中保持较高活性，具体应用包括但不仅限于：
[0021]在医药生产过程中，此突变几丁质酶既可以作为微生物抑制剂来制备眼科制剂，也可以作为抗真菌药物的添加剂应用于真菌疾病的治疗。在食品工业中，此突变几丁质酶可以用于几丁质寡糖的生产，既能作为抗微生物剂和免疫增强剂，激活宿主防御系统；又可以用作骨关节炎、风湿性关节炎治疗剂和食品添加剂，调节人体健康。在生物技术产业中，此突变几丁质酶可以和其它细胞壁降解酶一起用于真菌原生质体的制备。在植物病害防治过程中，此突变几丁质酶可以作为生防制剂来预防植物病原体和害虫，能够快速水解植物病害真菌的细胞壁，从而导致细胞裂解，进而杀死病原真菌。
附图说明
[0022]图1为蛋白纯化SDS
‑
PAGE图。
[0023]图2为以胶体几丁质为底物野生型WT和突变体E287A的相对酶活性。
[0024]图3为突变体E287A与野生型WT降解胶体几丁质的产物谱。
[0025]图4为突变体E287A与野生型WT降解出芽短梗霉菌渣相对酶活。
[0026]图5为突变体E287A与野生型WT降解出芽短梗霉菌渣产物谱。
具体实施方式
[0027]下面结合附图以及具体实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变的几丁质酶，所述突变的几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.编码权利要求1所述突变的几丁质酶的基因；优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。3.含有权利要求2所述基因的重组载体；优选的，所述重组载体为重组表达载体；更优选，所述重组载体的骨架载体来源于pET
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15b、pET
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22b或pET
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28a。4.包含权利要求3所述重组载体的重组菌株；优选的，所述重组菌株为大肠杆菌；更优选，大肠杆菌BL2...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀福全，王禄山，夏光明，吴秀芸，
申请(专利权)人：山东弥美生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：