用于表征纤维素底物可及性的重组酶及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于表征纤维素底物可及性的重组酶及其制备方法。本发明专利技术通过GenBank获取纤维素酶基因序列，将优化后的纤维素酶基因序列合成并克隆至荧光蛋白基因序列之前，得到融合质粒，通过T4 DNA连接酶将酶切后pPICZαA大片段和融合质粒目的DNA片段连接，得到重组表达载体质粒，将重组表达载体质粒电转入毕赤酵母X

【技术实现步骤摘要】
用于表征纤维素底物可及性的重组酶及其制备方法


[0001]本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及一种用于表征纤维素底物可及性的重组酶及其制备方法。

技术介绍

[0002]目前化石燃料（煤、石油和天然气）的消耗量逐年增加，在过去的5年里每年增长3.1%，这不仅导致了化石资源储备的逐渐枯竭，而且会对环境带来全球变暖等不可逆转的负面影响。生物质作为一种新兴资源，具有资源提供可持续性的特点，并且在价格上与石油相比具有竞争力，这为生产有机燃料和化学品开辟了一条新途径。据2021年统计，我国生物质资源平均每年产出高达34.94亿吨，并且会以1.1%的增长率逐年增加。
[0003]根据基因型和环境条件的不同，生物质的组成可能都不相同，一般来说，各种成分的含量分别是纤维素38
‑
50%、半纤维素23
‑
32%、木质素12
‑
25%，其他次要成分为果胶、蛋白质、可提取物和灰分。其中，作为主体的纤维素是一种由1250
‑
12500个D
‑
葡萄糖残基通过β
‑
1,4糖苷键连接而成的线性多糖。由此发展出的纤维素基产业是一个新兴行业，从依靠光合作用生存的生物质原材料中提取出各类化学单体，利用发酵和生物催化技术代替传统的化学合成技术，聚合成高分子化合物，之后再经过一系列的加工步骤，最终转化为生物基产品，取代化石基产品。
[0004]纤维素转化成单糖是其资源利用的重要方式，但是植物在进化过程中形成了表现在超微结构和分子结构方面的抗降解屏障，是降解纤维素的关键限制因素，因此，纤维素在降解前需要经过预处理，克服抗降解屏障的顽固性，提高降解效率。目前，有许多可用的预处理工艺，包括物理预处理、化学预处理和生物预处理。对于生物预处理工艺而言，纤维素对纤维素酶的可及性(CAC)是反应预处理效果、优化预处理工艺、以及实现纤维素资源化利用的重要前提。传统上有各种方法用于测定CAC，例如，以分子氮为探针分子的经典brunauer
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emmett
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eller (BET)方法已被广泛应用于测定固体基质，然而，N2在分子大小上远远小于纤维素酶，导致CAC被高估。通常生物质在测量之前需要进行干燥，但常规干燥可能导致纤维角化和多孔结构塌陷，于是一些适合于确定湿生物质基质的孔隙体积或纤维素可及性的方法被开发出来，如溶质排斥法。但溶质排斥技术存在操作繁琐、对纤维素无特异性、不能测定外表面积、不适合测定绝对孔径和体积分布、易受孔形和渗透压的影响等缺点。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中纤维素底物可及性的表征不够准确、方法不够简便的问题，本专利技术提供了一种用于表征纤维素底物可及性的重组酶及其制备方法。本专利技术通过GenBank获取纤维素酶基因序列，将优化后的纤维素酶基因序列合成并克隆至荧光蛋白基因序列之前，得到融合质粒，通过T4 DNA连接酶将酶切后pPICZαA大片段和融合质粒目的DNA片段连接，得到重组表达载体质粒，将重组表达载体质粒电转入毕赤酵母X
‑
33感受态细
胞，得到毕赤酵母重组菌株，将毕赤酵母重组菌株培养后收集、纯化，得到重组酶。获得的用于表征纤维素底物可及性的重组酶能够使得纤维素酶酶组分与底物的结合可视化，为研究生物质抗降解屏障和指导预处理工艺优化提供了技术支持。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是：一种用于表征纤维素底物可及性的重组酶，所述重组酶由纤维素酶和荧光蛋白构成。
[0007]优选地，所述纤维素酶选自外切葡聚糖酶Cel7A、内切葡聚糖酶Cel5A和β
‑
葡萄糖苷酶BglⅠ中的任意一种，所述荧光蛋白选自红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白中的任意一种。
[0008]优选地，所述重组酶为由外切葡聚糖酶Cel7A和红色荧光蛋白构成的重组酶Cel7A
‑
M。
[0009]优选地，所述重组酶为由内切葡聚糖酶Cel5A和绿色荧光蛋白构成的重组酶Cel5A
‑
G。
[0010]优选地，所述重组酶为由β
‑
葡萄糖苷酶BglⅠ和蓝色荧光蛋白构成的重组酶Bgl
Ⅰ‑
B。
[0011]本专利技术同时提供了上述用于表征纤维素底物可及性的重组酶的制备方法，包括以下步骤：（1）重组酶基因的设计与合成通过GenBank获取纤维素酶基因序列，在基因序列N端添加EcoRⅠ酶切位点和6
×
His标签，并按照毕赤酵母X
‑
33密码子偏好性进行序列优化，将优化后的纤维素酶基因序列合成并克隆至荧光蛋白基因序列之前，得到融合质粒；（2）重组表达载体质粒的构建根据表达载体pPICZαA与融合质粒上的酶切位点，同时使用EcoRⅠ和NotⅠ对其进行双酶切，胶回收酶切后pPICZαA大片段和融合质粒目的DNA片段，通过T4 DNA连接酶将二者连接，得到重组表达载体质粒；（3）重组毕赤酵母菌株的构建及诱导表达将重组表达载体质粒电转入毕赤酵母X
‑
33感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株，将毕赤酵母重组菌株培养后收集、纯化，得到重组酶。
[0012]优选地，所述步骤（1）的纤维素酶基因序列为里氏木霉外切纤维素酶Cel7A、内切纤维素酶Cel5A和β
‑
葡萄糖苷酶BglⅠ基因序列中的任意一种，荧光蛋白基因序列为红色荧光蛋白载体pmCherry
‑
N1、绿色荧光蛋白载体pEGFP
‑
N1和蓝色荧光蛋白载体pEBFP
‑
N1基因序列中的任意一种，融合质粒为pmCherry
‑
Cel7A、pEGFP
‑
Cel5A、pEBFP
‑
BglⅠ中的任意一种。
[0013]优选地，所述步骤（2）的重组表达载体质粒为pPICZαA
ꢀ‑
Cel7A
‑
M、pPICZαA
ꢀ‑
Cel5A
‑
G和pPICZαA
ꢀ‑
Bgl
Ⅰ‑
B中的任意一种。
[0014]优选地，所述步骤（3）将重组表达载体质粒电转入毕赤酵母X
‑
33感受态细胞前，使用限制性内切酶PmeⅠ对重组表达载体质粒进行单酶切，使重组表达载体质粒由环状变为线性。
[0015]优选地，所述步骤（3）将毕赤酵母重组菌株培养后收集、纯化是将构建成功的重组菌株置于装有YPD培养基的容器中，于30℃、250rpm条件下培养12~18 h作为种子液，再将种
子液按1%的接种量接于装有BMGY发酵培养基的容器中，于30℃、250rpm条件下培养18~36 h，室温下5000 rpm离心10 min，收集上清液，，将上清液过镍柱进行纯化，20 mM咪唑洗脱，随后通过透析除去洗脱液中的咪唑和氯化钠等小分子物质，得到重组酶。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于表征纤维素底物可及性的重组酶，其特征在于：所述重组酶由纤维素酶和荧光蛋白构成。2.根据权利要求1所述的用于表征纤维素底物可及性的重组酶，其特征在于：所述纤维素酶选自外切葡聚糖酶Cel7A、内切葡聚糖酶Cel5A和β
‑
葡萄糖苷酶BglⅠ中的任意一种，所述荧光蛋白选自红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白中的任意一种。3.根据权利要求2所述的用于表征纤维素底物可及性的重组酶，其特征在于：所述重组酶为由外切葡聚糖酶Cel7A和红色荧光蛋白构成的重组酶Cel7A
‑
M。4.根据权利要求2所述的用于表征纤维素底物可及性的重组酶，其特征在于：所述重组酶为由内切葡聚糖酶Cel5A和绿色荧光蛋白构成的重组酶Cel5A
‑
G。5.根据权利要求2所述的用于表征纤维素底物可及性的重组酶，其特征在于：所述重组酶为由β
‑
葡萄糖苷酶BglⅠ和蓝色荧光蛋白构成的重组酶Bgl
Ⅰ‑
B。6. 如权利要求1
‑
5任一项所述用于表征纤维素底物可及性的重组酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）重组酶基因的设计与合成通过GenBank获取纤维素酶基因序列，在基因序列N端添加EcoRⅠ酶切位点和6
×
His标签，并按照毕赤酵母X
‑
33密码子偏好性进行序列优化，将优化后的纤维素酶基因序列合成并克隆至荧光蛋白基因序列之前，得到融合质粒；（2）重组表达载体质粒的构建根据表达载体pPICZαA与融合质粒上的酶切位点，同时使用EcoRⅠ和NotⅠ对其进行双酶切，胶回收酶切后pPICZαA大片段和融合质粒目的DNA片段，通过T4 DNA连接酶将二者连接，得到重组表达载体质粒；（3）重组毕赤酵母菌株的构建及诱导表达将重组表达载体质粒电转入毕赤酵母X
‑
33感受态细胞，得到毕赤酵母重组菌株，将毕赤酵母重组菌株培养后收集、纯化，得到重组酶。7.根据权利要求6所述的用于表征纤维素底物可...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冠华，苑琳，党雅茹，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：