一种内切葡聚糖酶编辑基因及其编码酶的应用制造技术

本发明专利技术提供一种内切葡聚糖酶编辑基因及其编码酶的应用，属于基因技术领域。为了解决现有技术当中内切葡聚糖酶表达量低、热稳定性较差等问题。本发明专利技术提供一种内切葡聚糖酶，所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。提供内切葡聚糖酶的生产新途径，提高内切葡聚糖酶活力。葡聚糖酶活力。葡聚糖酶活力。

【技术实现步骤摘要】
一种内切葡聚糖酶编辑基因及其编码酶的应用


[0001]本专利技术属于基因
，具体涉及一种内切葡聚糖酶编辑基因及其编码酶的应用。

技术介绍

[0002]为合理地利用生物质资源，提高农业废弃物资源的利用效率，利用丝状真菌产生的纤维素酶将生物质纤维素降解并转化为高附加值化学品和生物燃料，有效促进绿色农业的发展。纤维素酶主要为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β
‑
葡萄糖苷酶的共同作用。内切葡聚糖酶作用于纤维素分子的无定形区域，通过随机切割分子间的β
‑
1,4
‑
糖苷键来释放寡糖，外切葡聚糖酶作用于纤维素长链的两端，由外向内水解β
‑
1,4
‑
糖苷键，以释放出纤维低聚糖、纤维二糖或葡萄糖。β
‑
葡萄糖苷酶水解纤维二糖和纤维寡糖为葡萄糖。然而，丝状真菌因其纤维素酶系组成不合理，酶活力较低，并且丝状真菌在发酵过程中往往难以控制等原因制约了纤维素降解技术的发展。此外，不同的工业应用中对纤维素酶各组分比例要求不同，如纺织业需要高酶活性内切葡聚糖酶。因此，可利用酵母等作为宿主进行异源表达，明确内切葡聚糖酶的理化性质，提高酶比活力，降低生产成本，是提升纤维素酶高效利用的重要途径。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了解决现有技术当中内切葡聚糖酶表达量低、热稳定性较差等问题。
[0004]本专利技术提供一种内切葡聚糖酶，所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0005]本专利技术提供一种编码内切葡聚糖酶的基因，编码内切葡聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术提供一种携带上述的基因的重组载体。
[0007]进一步地限定，重组载体的出发载体为pPIC9K。
[0008]本专利技术提供一种重组微生物细胞，所述重组微生物细胞携带上述的基因，或上述的重组载体的重组微生物细胞。
[0009]本专利技术提供所述重组微生物细胞为真核微生物细胞或原核微生物细胞。
[0010]本专利技术提供上述的内切葡聚糖酶、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的重组微生物细胞在制备内切葡聚糖酶中的应用。
[0011]本专利技术提供一种生产内切葡聚糖酶的方法，所述方法是采用上述的重组微生物细胞发酵获得内切葡聚糖酶。
[0012]进一步地限定，微生物细胞为毕赤酵母细胞。
[0013]发酵利用的培养基为MGY培养基(g/L)(10％(v/v)甘油100mL，ddH2O 800mL，10
×
YNB 100mL，500
×
B 2mL)和BMMY培养基(g/L)(酵母提取物10g，蛋白胨20g，KH2PO
4 11.8g，
K2HPO4·
3H2O 5.03g，溶于895mL水)；发酵条件：30℃，250rpm培养至OD
600
达2
‑
6；2500
×
g离心8min，保留菌体沉淀，悬浮菌体后，转接至BMMY培养基中(BMMY)，30℃，250rpm培养7d，并补充甲醇浓度为0.5％
‑
1％(v/v)，离心后取上清。
[0014]本专利技术提供上述的内切葡聚糖酶在提高内切葡聚糖酶对离子液体1
‑
乙基
‑
3甲基咪唑醋酸盐耐受性中的应用。
[0015]本专利技术提供上述的内切葡聚糖酶、上述的编码基因、上述的重组载体、上述的重组微生物细胞在降解纤维素中的应用。
[0016]本专利技术提供一种生产还原糖的方法，.所述方法是采用上述的内切葡聚糖酶，反应温度为60℃，pH值为5.0，反应30min。
[0017]有益效果：(1)本专利技术提供了一种具有特定碱基序列的内切葡聚糖酶，并且成功的采用食品安全菌株毕赤酵母对内切葡聚糖酶进行异源表达，表达量较高，本专利技术的方法安全、高效，可应用于纤维素酶制剂的规模化生产中。
[0018](2)本专利技术提供的内切葡聚糖酶纯酶具有较高的比活力，可高达94.17U/mg，并且内切葡聚糖酶具有较好的热稳定性。
[0019](3)本专利技术的内切葡聚糖酶对羧甲基纤维素钠为底物的转化率较高，经计算得到还原糖的产量为104.3mg。
[0020](4)本专利技术提供的内切葡聚糖酶在离子液体中具有较好的稳定性，可应用于纤维素酶和离子液体协同降解生物质。
附图说明
[0021]图1为目的基因克隆；其中，M是Marker；1是eg5b的目的条带；
[0022]图2为重组载体的电泳图，其中，M是Marker；1是eg5b
‑
pPIC9K；2是pPIC9K；
[0023]图3为重组载体PCR图，M是Marker；1
‑
3是阳性克隆，4是阴性对照，5是空白对照；
[0024]图4为毕赤酵母转化子(P.pastoris
‑
eg5b)的PCR验证；其中，M是Marker，1
‑
22是重组毕赤酵母转化子1
‑
22的PCR验证结果，其中4，6，7，9，11，15，17，19为8株HIS
+
Mut
+
表型的重组转化子；
[0025]图5为诱导时间对重组菌株酶活力的影响；其中，横坐标是时间，纵坐标是酶活力；
[0026]图6为不同诱导时间毕赤酵母重组菌株上清液的SDS
‑
PAGE；其中，其中，M是Marker，泳道1是诱导168h，2是诱导144h,，3是诱导120h，4是诱导96h，5是诱导72h，6是诱导48h，7是诱导24h；
[0027]图7为重组蛋白的Western blot验证；其中，M是Marker，1
‑
4是EG5B；
[0028]图8为重组蛋白最适温度；其中，横坐标是温度，纵坐标是相对酶活力；
[0029]图9为重组蛋白最适pH值；其中，横坐标是pH，纵坐标是相对酶活力；
[0030]图10为重组蛋白温度稳定性；其中，横坐标是温度，纵坐标是相对酶活力。
具体实施方式
[0031]1‑
乙基
‑3‑
甲基咪唑醋酸盐([EMIM][CH3COO]，货号：W131887)购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
[0032]实施例1.重组毕赤酵母分泌表达系统的构建
[0033]1.目的片段的克隆：提取Talaromyces endophyticusNEAU
‑
6总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，使用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP
‑
5.0)对信号肽进行预测，前18个氨基酸序列(MKPETLAAILSISAVAFG)为信号肽序列，在目的片段的克隆时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内切葡聚糖酶，其特征在于，所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种编码内切葡聚糖酶的基因，其特征在于，编码内切葡聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.携带权利要求2所述的基因的重组载体。4.一种重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞携带权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体的重组微生物细胞。5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞为真核微生物细胞或原核微生物细胞。6.根据权利要求5所述的重组微生物细胞，其特征在于，微生物细胞为毕赤酵母细胞。7.权利要求1所述的内切葡聚糖酶、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必弦，刘鑫，胡小梅，孙以新，高云飞，王艳萍，刘秀林，王雪扬，赵克臻，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院大豆研究所，
类型：发明
国别省市：