具备高酶活和高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突变体及应用制造技术

本申请提供了具备高水解活性和高葡萄糖耐受性的β

【技术实现步骤摘要】
具备高酶活和高葡萄糖耐受性的
β
‑
葡萄糖苷酶突变体及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及β
‑
葡萄糖苷酶突变体，具体涉及一种具有高效催化活性和高葡萄糖耐受性的β
‑
葡萄糖苷酶突变体及其筛选和应用。

技术介绍

[0002]木质纤维素是自然界中最丰富的可再生生物质资源之一，可以作为生产生物燃料和化学品的原料，具有成本低、可再生等优势，应用前景广阔。由于天然木质纤维素结构复杂、难以降解，要实现木质纤维素廉价而高效的生物转化，不仅需要一整套完备的生产工艺，还需要选择高效的生物酶系对其进行水解。目前最有前景的低成本木质纤维素生物转化策略包括整合生物加工技术(Consolidated BioProcessing，CBP)和整合生物糖化技术(Consolidated Bio
‑
Saccharification,CBS)。整合生物糖化是一种新型的木质纤维素生物转化策略，以热纤梭菌这一高效木质纤维素降解菌株为全菌催化剂，首先将木质纤维素中的多糖转化为发酵糖，然后通过下游偶联各种发酵工艺，从而实现各种目标化学品的生物合成，极大的拓宽了木质纤维素生物转化产品的品类和市场。与其它木质纤维素生物转化技术相比，CBS技术直接利用预处理秸秆为底物，在高温厌氧条件下同步实现酶的生产和底物的水解，不需外加纤维素酶，故而同时具备成本低廉和产品出口灵活的优势。
[0003]热纤梭菌通过分泌纤维小体实现了对木质纤维素的高效降解。纤维小体是由脚架蛋白将多种降解木质纤维素的酶整合到一起形成的多酶复合体，具有非常高的纤维素降解活性。纤维小体降解纤维素的主要产物是纤维二糖，但是纤维二糖对纤维小体的酶活存在严重的产物反馈抑制效应。β
‑
葡萄糖苷酶(β
‑
D
‑
Glucosidase，BGL)能够将纤维二糖降解成葡萄糖，从而可以解除产物对纤维小体的反馈抑制。已有研究表明，向纤维小体体系中额外添加BGL能极大的缓解产物的反馈抑制，从而能够积累较高浓度的葡萄糖。
[0004]β
‑
葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是一种纤维素酶，能够水解结合于末端非还原性的β
‑
D
‑
葡萄糖苷键，释放出β
‑
D
‑
葡萄糖。在纤维素的降解过程中，β
‑
葡萄糖苷酶能将其他纤维素酶产生的纤维二糖和纤维寡糖水解为葡萄糖，对纤维素的完全降解起到了关键作用。同时，β
‑
葡萄糖苷酶能有效地消除纤维二糖对外切纤维素酶和纤维二糖水解酶的产物抑制作用，提高整体纤维素酶的催化效率，是纤维素降解过程的关键限速酶。然而，在糖化过程中，随着葡萄糖的逐渐积累，高浓度的葡萄糖产物同样会对β
‑
葡萄糖苷酶产生一定的反馈抑制，从而影响高载量底物糖化的效果，在糖化过程的中后期底物降解的效率显著下降。因此，现阶段需要开发高水解活性且对葡萄糖具有高耐受性的突变体酶，以期更好地满足应用需求。目前尚未见相关报道。

技术实现思路

[0005]针对适用于CBS技术的β
‑
葡萄糖苷酶由于反馈抑制导致酶活下降的现状，本申请提供了一种具备高水解活性和高葡萄糖耐受性的β
‑
葡萄糖苷酶突变体及其应用。与野生型CaBGL相比，本申请所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体的催化活性和葡萄糖耐受性有了大幅度提
高，为整合生物糖化工艺性能的提升提供了新的酶组件和研究基础，具有广泛的应用前景，有望建立新一代的CBS全菌催化剂。
[0006]本专利技术的技术方案：具备高酶活和高葡萄糖耐受性的β
‑
葡萄糖苷酶突变体，所述β
‑
葡萄糖苷酶突变体具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体的比活力均显著高于野生型，葡萄糖耐受性得到的显著的提升。以纤维二糖为底物，突变体酶活性比野生型CaBGL提高2.13倍和1.34倍，在270mM葡萄糖条件下，突变体酶活性比野生型提高2.81倍和1.5倍，产生了不可预料的技术效果，具有重要的实际应用价值。此外，所述突变体酶在以热纤梭菌上清液进行体外糖化时，不同天数取样时，添加突变体酶的产糖量高于野生型26.01％
‑
35.86％和12.86％
‑
20.60％，充分说明其具备高酶活和高高葡萄糖耐受性，性能优异。
[0007]编码如前所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体的DNA分子，其核苷酸序列选自如下(1)或(2)：(1)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(2)如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
[0008]一种分离的重组载体，含有如前所述的编码β
‑
葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列的表达载体。
[0009]一种宿主细胞，包含如前所述的分离的重组载体；所述的宿主细胞不包括动物植物品种。
[0010]一种工程菌株，携带有如前所述的重组载体；所述工程菌株为重组大肠杆菌TOP10菌株。
[0011]一种制备如前所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体的方法，包括以下步骤：(1)采用权利要求3所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组β
‑
葡萄糖苷酶突变体的表达；(3)回收并纯化所表达的具备高酶活和高葡萄糖耐受性的β
‑
葡萄糖苷酶突变体。
[0012]如前所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体用于水解糖苷或寡糖化合物非还原性末端的β
‑
D
‑
葡萄糖苷键生成β
‑
D
‑
葡萄糖的用途。其中，所述β
‑
葡萄糖苷酶突变体适用于采用热纤梭菌为全菌催化剂的整合生物糖化技术。
[0013]一种基于嗜热荧光蛋白TGP的突变体高通量筛选方法，包括以下步骤：
[0014](1)将嗜热荧光蛋白TGP与CaBGL融合表达，根据荧光蛋白定量的标准曲线测定融合蛋白的表达量；所述的融合表达具体为：采用无缝克隆的方式将BGL和TGP融合并构建重组质粒、进而表达纯化。
[0015](2)将步骤(1)表达的融合蛋白稀释到所需浓度，利用pNPG法测定酶活性。
[0016](3)根据步骤(2)测定的酶活性，筛选得到高活性突变体。
[0017]所述突变体高通量筛选方法，综合利用理性设计、随机突变和半理性设计相结合的方法对野生型CaBGL进行改造，最终得到高水解活性和高葡萄糖耐受性的突变体酶，从而满足了CBS技术对β
‑
葡萄糖苷酶的需求，解决了现有技术存在的技术难题，对于建立新一代的CBS全菌催化剂具有重要的意义。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019](1)本专利技术提供了具备高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具备高酶活和高葡萄糖耐受性的β
‑
葡萄糖苷酶突变体，其特征在于：所述β
‑
葡萄糖苷酶突变体具有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列选自如下（1）或（2）：（1）如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。3.一种分离的重组载体，其特征在于：含有权利要求2所述的编码β
‑
葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列的表达载体。4.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求3所述的分离的重组载体；所述的宿主细胞不包括动物植物品种。5.一种工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株携带有权利要求 3所述的重组载体，所述工程菌株为重组大肠杆菌TOP10菌株。6.一种制备权利要求1所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）采用权利要求3所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；（2）培养重组菌株，诱导重组β
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔球，游偲，郑欣，陈超，冯银刚，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：