本发明专利技术提供了一种几丁质酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。利用本发明专利技术所述的几丁质酶N端截短突变体降解几丁质，整个酶解过程反应条件温和、无污染且特异性强。通过本发明专利技术的几丁质酶N端截短突变体水解生成的几丁寡糖比壳寡糖有更好的生物学活性，同时产物也可做到定制，具有广泛的工业应用前景。具有广泛的工业应用前景。具有广泛的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种几丁质酶N端截短突变体及其应用
[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种几丁质酶N端截短突变体及其应用。
技术介绍
[0002]几丁质又称壳多糖(chitin)，分子式为[C8H13O5N]n
，为N
‑
乙酰葡糖胺(N
‑
acetyl
‑
D
‑
glucosamine)通过β
‑
1,4糖苷键连接聚合而成的结构聚多糖，广泛存在于水生(如虾蟹壳，硅藻等)和陆地(如昆虫外壳，真菌细胞壁等)生态系统中。几丁质也是海洋环境中含量最为丰富的可再生资源，水产养殖业和加工业的迅速发展造成了大量虾蟹壳废弃物的积累，这些副产品的处理造成了巨大的资源浪费和严重的环境污染。其中，虾蟹壳废弃物干重中的几丁质含量在20
‑
35％左右，几丁质也是虾蟹壳中最有价值的部分。目前，几丁质的绿色开发及应用已经成为科研热点。
[0003]几丁质的降解产物是高附加值的几丁质寡糖、几丁单糖(GlcNAc)及其对应衍生物等，具有抗微生物、抗氧化、基因治疗、免疫细胞增殖和肿瘤生长抑制的作用，也可作为添加剂被广泛应用于饲料和食品中。GlcNAc是生物体内合成很多功能大分子物质，如透明质酸、硫酸角质素和硫酸软骨素的前体，在促进关节滑液合成并减缓关节疼痛，增加皮肤透明质酸含量，改善糖尿病与肝炎症状，增进免疫能力和抗癌等方面起到重要作用。几丁质寡糖和几丁单糖在现阶段的制备方法有化学提取法，壳寡糖乙酰化法。化学提取法一般使用的是酸水解法，利用强酸降解几丁质为氨基葡萄糖，经乙酰化后获得N
‑
乙酰氨基葡萄糖；或用稀酸直接降解几丁质生成几丁质寡糖。化学提取法反应剧烈，成本高，而且环境污染严重，几丁质寡糖产物聚合度低，因此生物酶法绿色降解几丁质现已成为科研热点。生物酶法降解几丁质制备几丁质寡糖和几丁单糖，具有反应过程温和，生物活性好以及高效利用废弃物几丁质资源的优点。
[0004]几丁质酶按照糖苷键的切割方式可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶及β
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖苷酶。内切几丁质酶可随机作用于几丁质长链的任何一个糖苷键，并将它水解成几丁质寡糖。外切几丁质酶与内切几丁质酶不同，其可从几丁质糖链非还原末端将几丁质降解为几丁二糖(GlcNAc)2。β
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖苷酶可以将几丁二糖(GlcNAc)2水解生成GlcNAc。几丁质酶将废弃物几丁质降解生成几丁质寡糖和几丁单糖，反应条件温和，绿色环保及其原料低成本和高产出，符合工业生产要求。例如，专利CN201710933796.X提供了一个具有2个催化域，且在低温条件下具有较高活性的几丁质酶P1724。专利CN202010795529.2则公开了一种几丁质酶chiam及其制备方法和应用。
[0005]因此，进一步挖掘具有高酶活的几丁质酶、高效利用富含几丁质的生物质具有重要意义。
技术实现思路
[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种N端截短的几丁质酶突变体及其应用。利用本专利技术所述的N端截短的几丁质酶降解几丁质，整个酶解过程反应条件温和、无污染且特异
性强。通过本专利技术的N端截短的几丁质酶水解生成的几丁寡糖比壳寡糖有更好的生物学活性，同时产物也可做到定制，具有广泛的工业应用前景。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]一方面，本专利技术提供了一种N端截短的几丁质酶突变体，所述的几丁质酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0009]在某些实施例中，野生型几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]另一方面，本专利技术提供了一种编码上述突变体的核酸分子。
[0011]具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
[0012]进一步具体地，所述的核酸分子序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
[0013]又一方面，本专利技术提供了一种载体，所述的载体包含上述核酸分子。
[0014]具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体。
[0015]进一步具体地，所述的载体为pET22b。
[0016]又一方面，本专利技术提供了一种包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
[0017]具体地，所述的宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过本领域技术人员已知的方法将本专利技术所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等方法。
[0018]进一步具体地，所述的宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
[0019]又一方面，本专利技术提供了上述核酸分子、载体或宿主细胞在制备几丁质酶突变体中的应用。
[0020]又一方面，本专利技术提供了一种上述几丁质酶突变体的制备方法，所述的方法包括以下步骤：
[0021](1)将上述核酸分子与质粒载体连接，得到重组质粒；
[0022](2)将所述重组质粒转化至克隆菌株，得到重组克隆菌株；
[0023](3)提取所述重组克隆菌株中的质粒，转化至表达菌株，得到重组表达菌株；
[0024](4)将重组表达菌株进行诱导培养，收集菌体并破碎，得到几丁质酶。
[0025]具体地，所述的载体为pET22b。
[0026]具体地，所述的重组克隆菌株为E.coli DH5α。
[0027]具体地，所述的重组表达菌株为E.coli BL21(DE3)。
[0028]具体地，步骤(4)中所述的诱导培养为：将重组表达菌株接入含有氨苄青霉素的第一LB培养基中在36
‑
38℃下培养12
‑
18h，再按照1％v/v的接种量接种至含氨苄青霉素的第二LB培养基中，在36
‑
38℃下培养至OD600＝0.6
‑
0.8，然后加入异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷，于25
‑
30℃，180
‑
200rpm下诱导8
‑
10h。
[0029]进一步具体地，所述的第一LB培养基或第二LB培养基中氨苄青霉素的浓度独立地为98
‑
102mg/mL。
[0030]进一步具体地，所述的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷在第二LB培养基中的终浓度为0.00008
‑
0.00012M。
[0031]又一方面，本专利技术提供了上述几丁质酶突变体在几丁质降解中的应用。
[0032]在某些实施例中，本专利技术提供的几丁质酶Δ30AfChiJ(SEQ ID NO.3)酶解胶体几丁质的产物主要为G本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种N端截短的几丁质酶突变体，其特征在于：所述的几丁质酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。2.一种编码权利要求1所述的几丁质酶突变体的核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。3.一种载体，其特征在于：所述的载体包含权利要求2所述的核酸分子；所述的载体包括质粒、病毒或噬菌体，优选为pET22b。4.一种宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞包含权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体；所述的宿主细胞包括微生物、植物或动物细胞，优选为大肠杆菌。5.权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞在制备几丁质酶突变体中的应用。6.一种权利要求1所述的几丁质酶突变体的制备方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：(1)将权利要求2所述的核酸分子与质粒载体连接，得到重组质粒；(2)将所述重组质粒转化至克隆菌株，得到重组克隆菌株；(3)提取所述重组克隆菌株中的质粒，转化至表达菌株，得到重组表达菌株；(4)将重组表达菌株进行诱导培养，收集菌体并破碎，得到几丁质酶。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的载体为pET22b；所述的重组克隆菌株为E.coli DH5α；所述的重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘丽霞，季风，何斌，杨登峰，阳丽艳，吴军华，
申请(专利权)人：广西华仁医学科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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