几丁质酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种几丁质酶突变体。与野生型相比，该突变体包含R89K、D149S和N169I三个突变位点，其在里氏木霉中的表达酶活提高了110%，取得了意料不到的技术效果，有利于降低该酶的生产成本，促进其在医药、农业、食品加工等领域中的广泛应用。中的广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
几丁质酶突变体


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体涉及一种几丁质酶。

技术介绍

[0002]几丁质又称甲壳素或甲壳质，是大多数真菌的细胞壁成分，也是真菌病害有效防治的限制因子之一。由于几丁质酶对真菌细胞壁物质有降解作用，故对于真菌病害的防治具有潜在的应用前景。几丁质酶的种类有微生物几丁质酶、植物几丁质酶和动物几丁质酶，产生几丁质酶的微生物包括细菌、放线菌和霉菌，而且不同的微生物产生的几丁质酶的类别和性质也不尽相同。几丁质酶是一种能够将几丁质分解成几丁质单糖——N
‑
乙酰基葡萄糖的酶。
[0003]不同生物来源的几丁质酶分子质量差异很大，一般在20～90ku内。其中微生物几丁质酶多为20～60ku，植物几丁质酶在20～45ku内，昆虫几丁质酶为40～85ku。几丁质酶的最适pH值在1.0～8.0内，等电点为3.1～10.0。几丁质酶的热稳定性良好，一般在4～60℃较为稳定，大多数几丁质酶的最适反应温度为40～60℃。许多金属离子尤其是重金属离子如Ar+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Sn2+、Co2+和Fe3+等对几丁质酶活力具有不同程度的影响。
[0004]几丁质酶在生物体中发挥的作用各不相同。微生物几丁质酶的主要作用是水解几丁质产生供其生长繁殖所需的碳源与能源，在自然界物质循环和能量循环中发挥着重要作用；植物几丁质酶在抗病原微生物方面具有防御和保护作用；昆虫几丁质酶主要与其胚胎后期发育和蜕皮相关；病毒编码的几丁质酶与其感染宿主的机制有关；几丁质酶在真菌、原生动物和非脊椎动物的生长和形态建立上也具有非常重要的作用。
[0005]目前，人们对于几丁质酶的应用主要集中于几丁质水解产物的开发与利用。
[0006]1、几丁质酶在医药领域中的应用几丁质酶将几丁质分解为几丁寡糖和其一些衍生物。例如壳寡糖和 N
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乙酰氨基葡萄糖。这些几丁寡糖具有多种生理功能，可激活人体巨噬细胞和淋巴细胞，增强机体免疫力，它们既有无毒、无过敏性、可生物相容、 可生物降解的优点，已广泛应用于抗癌的临床治疗以及保健食品的开发领域；2、几丁质酶在处理海洋渔业产生的废弃物中广泛应用海洋废弃物：虾、蟹、龙虾、磷虾等甲壳动物在食品加工过程中会产生大量副产品，主要由几丁质、碳酸钙和蛋白质组成，对其处理会产生大量的几丁质和壳多糖。目前，已经完成了关于海洋废弃物几丁质利用率以及一些具有生物活性的几丁单糖或寡糖生产的调查，由产几丁质酶的微生物或经纯化处理的几丁质酶水解几丁质生成N
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乙酰葡萄糖胺试验已经成功。
[0007]3、几丁质酶在生物防治中的应用在农业上几丁质酶可作为生物杀菌或杀虫剂，提高植物的抗病能力。传统方式是直接利用几丁质酶产生菌防治植物真菌病害。
[0008]由于微生物几丁质酶比动植物几丁质酶催化作用的pH值和温度范围更宽，且制备
相对更容易，所以国内外获得几丁质酶的方法主要是微生物发酵法。但目前几丁质酶的产量仍普遍偏低，严重限制了其推广与应用。

技术实现思路

[0009]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种新型几丁质酶突变体。与野生型相比，该突变体的酶活水平得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术涉及一种几丁质酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：89，149，169。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0012]在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0013]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：R89K，D149S，N169I。
[0014]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：R89K，D149S，N169I，R89K/D149S，R89K/N169I，D149S/N169I，R89K/D149S/N169I。
[0015]本专利技术还涉及编码上述几丁质酶突变体的DNA分子。
[0016]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0017]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0018]将上述的重组表达载体转入宿主细胞中，重组表达的几丁质酶突变体的酶活得到显著提升。
[0019]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
[0020]本专利技术提供的几丁质酶突变体包含R89K、D149S和N169I三个突变位点。与野生型相比，所述突变体在里氏木霉中的表达酶活提高了110%，摇瓶发酵酶活达到131U/mL，取得了意料不到的技术效果，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0021]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0022]菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，里氏木霉宿主菌Q4本公司保藏、载体pKL本公司保藏，Amp等购自上海生工生物工程有限公司。
ml裂解酶液（0.2g/10ml，0.7 M NaCl溶解，Sigma L1412）酶解2 h；取出酶解液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加5 ml 溶液2悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量溶液2悬浮分装（200
ꢀµ
l/管，108个/ml）。
[0032]2.3转化每个质粒 DNA取10 ul 加入到200
µ
l原生质体中，接着加入50
µ
l 25%PEG溶液轻轻混匀，冰浴20min；然后加入2 ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45
‑
55℃的上层半固体培养基，轻轻混匀后倒入含100
µ
g/ml潮霉素下层基础培养基，30℃黑暗培养数天至转化子长出。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：89，149，169。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士成，张玉忠，陈刚，鲍锴，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：