高比活碱性木聚糖酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体。本发明专利技术以野生型木聚糖酶H1为基础，提供了包含G40D，L45V，A57E/G，A59T/D，H61N，V65D/Q/T/S，F93Y，T95D，T103I，D104F，Y123T，Q132A，N143D，Q151S/D/N，G153K，A160K/R，N167D/S，I174V，F181R/N中至少一个突变位点的突变体。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于降低生产成本，促进其在造纸领域的广泛应用。促进其在造纸领域的广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
高比活碱性木聚糖酶突变体


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]木聚糖（Xylan）是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生物质资源。它存在于植物的细胞壁中以及几乎所有部位。
[0003]木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖或木糖的一类酶的总称。一个木聚糖分子的完全酶解需要几步酶促反应，作用于主链的有两种酶：β
‑
1，4
‑
木聚糖酶（l，4
‑
β
‑
D
‑
xylanohydrolase: EC3.1.2.8）和β
‑
木糖苷酶（1，4
‑
β
‑
D
‑
xylanxylohydrolase: EC3.2.1.37）。一般而言，前者从主链内部作用于木糖苷键，将木聚糖分解成低聚糖，而后者则作用于低聚木糖的末端，释放出木糖。
[0004]许多微生物可产生木聚糖酶。木聚糖酶的生物化学性质的获得主要来自于细菌和真菌木聚糖酶的研究。细菌所产木聚糖酶可大体分为两类：高分子量的耐酸木聚糖酶，低分子量的耐碱木聚糖酶。但在真菌中却没有这种差别，不过，低分子量木聚糖酶的耐碱性却是共同的。
[0005]饲料中的木聚糖本身难以被单胃动物消化，同时结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增加、养分与消化道内源酶的作用降低，从而阻碍营养物质，尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，降低饲料的利用率。研究结果表明，饲料中如果添加木聚糖酶，就可显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。
[0006]木聚糖酶可作为生物漂白剂用于造纸工业。木聚糖酶在造纸和纸浆工业中的重要性在于其取代了有毒的化学物质，同时通过酶法预处理可以回收该行业中有用的副产品。其漂白作用在于切开木质素和糖之间的键，松弛纸浆结构。扫描电镜研究显示，用木聚糖酶预处理后的纸浆在纸浆纤维的孔隙上有所提高，有助于其与起漂白作用的化合物的亲和。
[0007]在葡萄酒和日本大麦烧酒的生产中，已经有了木聚糖酶的应用研究。日本研究人员将耐酸性木聚糖酶Xy1C应用于日本大麦烧酒酿造中，结果发现该酶有助于提高发酵效率，增加酒精的产率。
[0008]木聚糖酶在造纸、食品、能源、饲料以及环境等领域的应用价值，已经得到了肯定，然而由于在天然材料中表达水平低、难以大规模生产、且产物难以纯化以及木聚糖的一些性质不能完全满足应用的要求。随着基因工程技术的发展，通过基因工程这一手段，利用生物反应器提高它的表达量并在分子水平上对木聚糖酶基因进行改造以解决一些木聚糖酶活性(如比酶活、抗逆性、pH值、热稳定性等)的缺陷已成为目前的研究热点。
IN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。例如，本专利技术可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
[0026]酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0027]培养基配方：大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨，2%琼脂糖；BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4
×
10
‑
5 %生物素，1%甘油；BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4
×
10
‑
5 %生物素，0.5%甲醇；LB
‑
AMP培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；LB
‑
AMP平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，1.5%琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；上层培养基：0.1%MgSO4，1%KH2PO4，0.6%(NH4)2SO4，1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%琼脂糖；下层培养基平板：2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4，1.5%KH2PO4，0.06%MgSO4，0.06%CaCl2，1.5%琼脂。
[0028]下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1 重组质粒的构建将来源于拟青霉（Paecilomyces. sp）的木聚糖酶基因（GeneBank ACS26244. 1）根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化，并在其起始密码子ATG前增加6个碱基GAATTC（EcoR I酶切位点），在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC（Not I酶切位点）。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该木聚糖酶命名H1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
[0029]用限制性内切酶EcoR I和Not I（Fermentas）对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌（Invitrogen），用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen）。
[0030]使用质粒小量制备试剂盒（Omega）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，将其命名为pPIC9K
‑
H1。
[0031]实施例2 高比酶活突变体的筛选
为了进一步提高木聚糖酶H1的酶活性，申请人对其进行蛋白结构分析。该蛋白是GH11家族木聚糖酶，其结构为β
‑
果冻卷的结构。申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。1.1设计PCR引物H1
‑
F1、H1
‑
R1：H1
‑
F1：GGCGAATTCATGATGATTGGTATCACTTCTTTTGC（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；H1
‑
R1：ATAGCGGCCGC TT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：40，45，57，59，61，65，93，95，103，104，123，132，143，151，153，160，167，174，181。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求1
‑
3任一所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李馨培，吴秀秀，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：