一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过添加米格列醇提高里氏木霉(Trichoderma reesei)生产纤维素酶产量的方法。利用葡萄糖

【技术实现步骤摘要】
一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程与
，具体涉及一种通过在培养基中添加米格列醇提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法。

技术介绍

[0002]石油、煤炭和天然气等化石能源的过度开发和利用导致储量日益减少、环境污染日益严重、气候变化以及自然灾害频发等系列问题，严重影响经济和社会的可持续发展。以秸秆为代表的木质纤维素类生物质资源储量丰富，通过生物炼制技术路线生产可再生且环境友好的生物能源及生物基化学品，对经济和社会的可持续发展具有十分重要的意义。然而，木质纤维素类生物质坚韧的超分子结构，需要高效的纤维素酶才能将纤维素水解为可发酵性糖，但纤维素酶生产成本高导致纤维素水解糖的成本高，成为木质纤维素类生物质资源生物炼制技术开发的主要瓶颈环节之一。
[0003]纤维素酶发酵高产菌株目前主要来自里氏木酶，里氏木霉的纤维素酶主要由三类酶组成：内切纤维素酶由纤维素非结晶区水解断裂糖苷键进而降低纤维素聚合度，外切纤维素酶从纤维素片段两端水解释放纤维二糖，β
‑
葡萄糖苷酶水解纤维二糖为葡萄糖，但这三类酶的生物合成均需要诱导。纤维素是天然诱导物，但是纤维素不溶于水，需要通过菌株本底低水平纤维素酶，在非均相催化和非最适反应温度条件下缓慢水解后才能释放以β
‑
二糖为主的真实诱导物，诱导纤维素酶合成，这一过程显著延长了纤维素酶发酵时间，相应降低了发酵罐的纤维素酶生产强度。由于丝状真菌纤维素酶液体深层发酵为高粘度非牛顿型流体，发酵罐生产强度低使纤维素酶发酵过程通风和搅拌混合的能耗成本极高，而且纯纤维素，特别是诱导效果最好的微晶纤维素价格昂贵。
[0004]目前液体深层发酵工业化生产纤维素酶过程中，乳糖是最经济的可溶性诱导物，但乳糖价格仍然较高，尤其在我国。另一方面，乳糖需要β
‑
半乳糖苷酶或β
‑
葡萄糖苷酶将其水解和转糖基后生成槐糖，才能诱导纤维素酶的生产，所以乳糖不是真正的诱导物，从而限制了纤维素酶液体深层发酵的生产效率(Plos One.,2013,8(5),e62631)。槐糖(β
‑
1,2
‑
二糖)已被证明是里氏木霉纤维素酶合成最高效的诱导物，其诱导能力是乳糖的200多倍(J.Bacteriol.,1962,83, 400
–
408)。但槐糖价格非常昂贵，之前公开了基于葡萄糖转苷反应制备混合物高效生产纤维素酶的方法(CN201610309126.6)，通过β
‑ꢀ
葡萄糖苷酶催化的转苷反应制备含槐糖混合物。然而在诱导过程中β
‑
葡萄糖苷酶会将强力诱导物槐糖水解从而使其丧失诱导能力，所以本专利技术通过米格列醇抑制β
‑
葡萄糖苷酶活性从而稳定槐糖在里氏木霉胞内浓度，进而可以持续诱导合成纤维素酶，从而提高纤维素酶产量。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的葡萄糖
‑
槐糖混合物诱导里氏木霉过程中槐糖被不断降解从而失去诱导效果的缺陷，从而降低里氏木霉合成纤维素酶产量的缺
陷，提供一种在发酵过程中添加米格列醇提高纤维素酶产量的方法。
[0007](二)技术方案
[0008]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种提高里氏木霉生产纤维素酶的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]S1.以葡萄糖
‑
槐糖混合物作为诱导物和碳源培养里氏木霉合成纤维素酶。
[0010]S2.培养基中添加米格列醇提高生成纤维素酶产量。
[0011]优选的，步骤S1中，所述的里氏木霉优选的为cre1基因突变的菌株，更优选的菌株为历史亩RutC30(ATCC 56765)。
[0012]优选的，步骤S1中，所述的葡萄糖
‑
槐糖混合物可以通过各种方式获得，更优选的利用β
‑
葡萄糖苷酶催化高浓度葡萄糖制备。
[0013]优选的，步骤S1中，培养里氏木霉的生孢培养基为30g/L麦芽浸粉和15g/L琼脂；产酶种子培养基：10g/L玉米浆和4g/L葡萄糖；发酵培养基：蛋白胨1g/L，尿素0.3g/L，(NH4)2SO4 2.8g/L， KH2PO4 4.0g/L，MgSO4
·
7H2O 0.6g/L，CaCl2
·
2H2O 0.8g/L， FeSO4
·
7H2O 250mg/L，MnSO4
·
H2O 85mg/L，ZnSO4
·
7H2O 70mg/L， CoCl2
·
2H2O 100mg/L，840μL MGD(葡萄糖与槐糖混合物)。
[0014]优选的，步骤S1中，里氏木霉生孢培养基的接种量为1～2μL， 28℃恒温培养7d；种子培养基的接种量为1％，28℃且150r/min摇瓶培养；发酵培养基的接种量为8％在28℃且150r/min摇瓶培养 60h。
[0015]优选的，步骤S2中，在发酵过程中加入米格列醇，添加量为0.5 g/L
‑
5g/L，更优选的为1g/L。
[0016]与现有技术相比本专利技术所具有的优点：
[0017]1.本专利技术可以在以葡萄糖
‑
槐糖混合物诱导里氏木霉合成纤维素酶过程中提高纤维素酶产量。
[0018]2.本专利技术可以降低诱导物使用量，节省成本。
[0019]3.本专利技术使用可溶性物质培养里氏木霉，提高纤维素酶生成强度，节省发酵过程中能耗。
附图说明
[0020]图1米格列醇可以有效抑制β
‑
葡萄糖苷酶；
[0021]图2发酵液中添加米格列醇提高里氏木霉生成纤维素酶产量。
具体实施方式
[0022]为了本领域技术人员能更好地理解并运用本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行具体说明。应指出的是，对本领域技术人员而言，在本专利技术构思主体下可进行适当调整以适应具体应用情况，但不可脱离本专利技术创造核心，这均属于专利技术保护范围。
[0023]实施例1：发现米格列醇可以抑制β
‑
葡萄糖苷酶
[0024]本申请发现米格列醇可以抑制里氏木霉β
‑
葡萄糖苷酶。其中米格列醇的CAS号为72432
‑
03
‑
2；里氏木霉来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.12768。具体操作步骤如下：
[0025]里氏木霉的生孢培养，将1～2μL木霉孢子接种于固体生孢培养基中，在28℃恒温培养箱中培养约5～7d，待平板表面均匀覆盖深绿色孢子时用适量灭菌后蒸馏水多次冲洗，获得的孢子液置于4℃保存待用。产孢培养基具体配制方法为：30g/L麦芽浸粉和15g/L琼脂。
[0026]里氏木霉的产酶种子培养，发酵培养前取0.5mL，4℃保存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高里氏木霉(Trichoderma reesei)生产纤维素酶的方法，其特征在于：S1：以葡萄糖
‑
槐糖混合物作为诱导物，培养里氏木霉合成纤维素酶。S2：培养基中加入米格列醇提高纤维素酶产量。2.根据权利要求1所述的提高里氏木霉生产纤维素酶的方法，其特征在于步骤S2中，米格列醇的添加量为0.1g/L
‑
4g/L。3.根据权利要求2所述的提高里氏木霉生产纤维素酶的方法，其特征在于，米格列醇的添加量可以根据发酵液中β
‑
葡萄糖苷酶的活性自行调节，主要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇昊，莫易，李江洪，龙婷婷，张鹏，于靖泽，
申请(专利权)人：重庆科技学院，
类型：发明
国别省市：