内切葡聚糖酶突变体TrepCel4-Aa及其应用制造技术

本发明专利技术公开了内切葡聚糖酶突变体TrepCel4

【技术实现步骤摘要】
内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa及其应用。

技术介绍

[0002]木质纤维素生物质是地球上用于工业生物精炼的最丰富、便宜和循环利用的原材料。木质纤维素生物质可通过工业生物精炼转化为纸质用品、纺织品及生物乙醇等。目前有超过200种化学品和多聚合物是通过生物精炼从木质纤维素生物质中提取。此外，农作物秸秆是重要的木质纤维素源之一，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β
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葡萄糖苷酶的协同作用可以高效水解纤维素。内切葡聚糖酶具有更高的水解纤维素的能力，因为它可以随机地从内部断开纤维素主链的β
‑
1,4
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糖苷键。内切葡聚糖酶现已广泛应用于工业生物精炼及动物饲料添加剂。
[0003]随着宏基因组筛选方法的广泛运用，目前已有多种内切葡聚糖酶从草食动物的瘤胃中获得，如驼鹿、绵羊、水牛、奶牛和骆驼。但是大部分候选纤维素酶没有被克隆和表征。具有高水解能力的纤维素酶对于生物炼制工业来说是必不可少的，以此减少纤维素酶的使用量，从而提高经济效益。内切葡聚糖酶通过底物结合口袋与底物锚定，进一步被活性催化位点催化。因此底物结合口袋的稳定决定了水解酶最终的催化效率。因此，挖掘瘤胃微生物宏基因组中内切葡聚糖酶可以为内切葡聚糖酶的开发提供新的研究思路，同时对底物结合口袋进行适当的定点突变，提高酶与底物结合稳定性，用作饲料酶制剂，可以提高饲料转化率，增加生产效益。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa及其应用，本专利技术从水牛瘤胃微生物基因组中得到一种内切葡聚糖酶，并进行突变获得内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa，然后进行表达、纯化，获得的酶液有助于在分离纤维素以及提升其在饲料、酶制剂等领域中的应用。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术提供了内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0007]进一步的，所述内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa是由氨基酸序列为SEQ ID No.1的内切葡聚糖酶的第201位的组氨酸突变为色氨酸以及第252位的谷氨酸突变为酪氨酸获得的。
[0008]进一步的，所述内切葡聚糖酶突变体只包含糖苷水解酶第5家族；其能够从内部水解纤维素的主链，且最适温度和最适pH分别为50℃和6.0。
[0009]本专利技术还提供了一种编码基因，其为编码所述的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0010]本专利技术还提供了包含所述的编码基因的重组表达载体。
[0011]本专利技术还提供了包含所述的编码基因的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌。
[0012]本专利技术还提供了所述的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa在制备用于降解纤维素的酶制剂中的应用。
[0013]进一步的，所述纤维素为天然木质纤维素；所述天然木质纤维素为稻秸、麦秸、羊草或甜菜渣。
[0014]进一步的，所述酶制剂中，内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa的浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。
[0015]本专利技术还提供了所述的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的优点和有益技术效果是：
[0017]本专利技术利用宏基因组学技术从水牛瘤胃微生物宏基因组中成功筛选出一种内切葡聚糖酶TrepCel4，然后根据原核系统密码子使用的偏好性及内切葡聚糖酶基因的GC含量和mRNA的二级结构，对该基因进行密码子优化，得到内切葡聚糖酶的优化基因序列，再对内切葡聚糖酶的底物结合口袋中的活性位点进行定点突变，将得到内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa在大肠杆菌中表达，分离纯化使内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa成功地在大肠杆菌中表达，该突变体酶具有良好的活性。本专利技术还以天然木质纤维素为底物证实了内切葡聚糖酶突变体酶TrepCel4
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Aa具有较高的水解能力，这为提高饲料纤维的消化率、改善动物生产性能方面提供了理论上的指导。
附图说明
[0018]图1为内切葡聚糖酶突变体的常规酶学性质结果图；
[0019]图2为内切葡聚糖酶突变体的SDS
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PAGE结果图；
[0020]图3为内切葡聚糖酶突变体降解四种天然底物的结果图。
具体实施方式
[0021]以下将结合实施例对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1：内切葡聚糖酶的筛选、突变及纯化表达
[0023]一、内切葡聚糖酶的筛选
[0024]本专利技术利用基因组学技术从水牛瘤胃微生物宏基因组中筛选得到一种内切葡聚糖酶TrepCel4，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0025]筛选步骤：1)用去离子水彻底冲洗麦秸3次用以去除附着于麦秸表面的可溶性多糖；2)麦秸于65℃条件下烘干24h，随后用粉碎机粉碎成长度为0.5mm，然后称重装入单独的尼龙袋中(2.5克/袋)；3)通过瘤胃瘘管将将尼龙袋放入水牛的瘤胃内；4)24h后将尼龙袋取出并用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)轻轻清洗尼龙袋表面以去除附着在袋子表面的瘤胃内容物；5)打开尼龙袋用天平秤取1g左右样品于5mL离心管中，加入3mL磷酸盐缓冲液，上下晃动30
秒，350rpm离心15min，去除悬浮液，倒立纱布上约1min，获得紧密连接微生物；6)提取微生物总DNA并进行宏基因组测序；7)利用FastQC软件质控后通过MEGAHIT软件进行拼接组装，筛选≥300bp的contigs作为组装的最终结果；8)通过MetaGene对contigs进行ORF预测，获得原核基因序列使用NCBI在线工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorg.html)进一步验证。选择序列大于等于100bp的基因，并翻译为氨基酸序列；9)使用CD
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HIT(http://www.bioinformatics.org/cd
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。2.根据权利要求1所述的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa，其特征在于，其是由氨基酸序列为SEQ ID No.1的内切葡聚糖酶的第201位的组氨酸突变为色氨酸以及第252位的谷氨酸突变为酪氨酸获得的。3.一种编码基因，其特征在于，其为编码权利要求1所述的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。4.包含权利要求3所述的编码基因的重组表达载体。5.包含权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：成艳芬，孟振祥，吕东海，朱伟云，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：