一种亚麻苦苷酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亚麻苦苷酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。所述突变体的氨基酸序列为以下(a)～(d)的任意一项或任意两项或任意三项或四项的的组合：(a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第263位的赖氨酸突变为脯氨酸；(b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第53位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；(c)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第366位的丝氨酸突变为精氨酸；(d)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第335位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第339位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸。本发明专利技术结合酶的分子设计和定点突变获得热稳定性和活性都显著提升的突变体，与野生型相比，突变体对生氰糖苷的降解效率显著提高，本发明专利技术为提高木薯食品以及含氰苷食品的食用安全性奠定基础。及含氰苷食品的食用安全性奠定基础。及含氰苷食品的食用安全性奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种亚麻苦苷酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及酶工程
，具体涉及一种亚麻苦苷酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]木薯(学名:Manihot esculenta)是大戟科、木薯属的可食用块根，是全球性的粮食作物。木薯中含有一类糖苷类植物次生代谢产物，称为生氰糖苷，亦称氰苷。研究表明，生氰糖苷具有生殖毒性、发育毒性和神经毒性等，并可能导致高剂量急性死亡，在食用木薯的人群中观察到痉挛性截瘫和热带共济失调性神经病。世界卫生组织报道，氰化物的膳食暴露风险主要来源于木薯。
[0003]木薯中的生氰糖苷有亚麻苦苷和百脉根苷，其中亚麻苦苷占据了木薯总氰苷的90％。亚麻苦苷酶(linamarase)特异性水解亚麻苦苷是去除木薯氰化物的关键步骤。前期研究结果表明，生氰糖苷化合物比较稳定，在加工中较难发生热降解，生氰糖苷的高效降解主要依赖于亚麻苦苷酶的水解作用。而在加工过程中往往伴随着木薯内源性亚麻苦苷酶的失活，导致生氰糖苷过高残留(Zhong Y,et al.Effect of ultrasonic pretreatment on eliminating cyanogenic glycosides and hydrogen cyanide in cassava.Ultrasonics Sonochemistry,2021,78(1):105742.，2021)。
[0004]亚麻苦苷酶属于糖苷水解家族1，是典型的(α/β)8圆桶状结构，天然分子量约在70KDa，理论氨基酸数为531，它能水解结合于末端的非还原性β
‑
D
‑
葡萄糖苷键，生成β
‑
D
‑
葡萄糖和对应的配基。对亚麻苦苷酶基因进行重组表达研究发现，重组酶存在的缺陷，首先是最适酶活为35℃，热稳定性差不利于生氰糖苷的有效水解。其次是表达载体不够完善，给亚麻苦苷酶的制备带来了困难：真核表达体系相较于原核表达体系更为复杂，表达周期长，表达量低。
[0005]因此，目前酶法降解木薯生氰糖苷的关键问题在于，基于合适的表达载体提升亚麻苦苷酶的热稳定性和催化活性，从而提升生氰糖苷的降解效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种热稳定性和活性好，能够高效降解生氰糖苷的亚麻苦苷酶，应用于酶法降解植物生氰糖苷，满足加工食品对于生物安全性的要求。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术以木薯(Manihot esculenta)亚麻苦苷酶(GenBank:AAB22162.1)为模板，对其进行定点突变，得到亚麻苦苷酶突变体。
[0009]所述突变体的氨基酸序列为以下(a)～(d)的任意一项或任意两项或任意三项或四项的组合：
[0010](a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第263位的赖氨酸突变为脯氨酸；
[0011](b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第53位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；
[0012](c)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第366位的丝氨酸突变为精氨酸；
[0013](d)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第335位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第339位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，是将氨基酸序列SEQ ID NO.1的第263位的赖氨酸突变为脯氨酸。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，是将氨基酸序列SEQ ID NO.1的第53位的苏氨酸突变为苯丙氨酸。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，是将氨基酸序列SEQ ID NO.1的第366位的丝氨酸突变为精氨酸。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，是将氨基酸序列SEQ ID NO.1的第335位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第339位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，是将氨基酸序列SEQ ID NO.1的第263位的赖氨酸突变为脯氨酸，第53位的苏氨酸突变为苯丙氨酸，第366位的丝氨酸突变为精氨酸。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，是将氨基酸序列SEQ ID NO.1的第263位的赖氨酸突变为脯氨酸，第53位的苏氨酸突变为苯丙氨酸，第366位的丝氨酸突变为精氨酸，第335位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第339位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸。
[0020]相比于野生型亚麻苦苷酶，上述亚麻苦苷酶突变体的热稳定性显著提升，且比活力显著提升，突变体对木薯生氰糖苷的降解效率显著提高。具体的，相较于野生型亚麻苦苷酶，突变体K263P、T53F、S366R、V335C
‑
F339C、K263P
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T53F
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S366R和K263P
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T53F
‑
S366R
‑
V335C
‑
F339C的ΔT
m
分别提高了3.2℃、3.3℃、1.9℃、2.9℃、3.9℃和5.5℃。S366R、K263P
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T53F
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S366R和K263P
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T53F
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S366R
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V335C
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F339C的比活力为82.4U/mg、83.9U/mg和85.1U/mg，比野生型(42.1U/mg)提高了1.95倍、1.99倍和2.02倍。
[0021]本专利技术的另一个目的是提供所述亚麻苦苷酶突变体的制备方法，包括但不限于微生物合成法。
[0022]本专利技术提供了上述亚麻苦苷酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9
‑
14所示。所述编码基因的核苷酸序列可以根据宿主细胞的密码子偏好性进行改造。
[0023]本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括原始表达质粒以及插入在原始表达质粒多克隆位点中的编码所述亚麻苦苷酶突变体的核苷酸序列。
[0024]作为优选，所述原始表达质粒为pMAL
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C2X。pMAL
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C2X具有麦芽糖结合蛋白助溶标签，本专利技术研究表明，利用pMAL
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C2X载体有助于提高目标蛋白表达量，且为可溶表达。
[0025]本专利技术提供了一种重组基因工程菌，所述重组工程菌中携带有上述重组表达载体。所述重组载体转化宿主细胞获得重组基因工程菌，所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞。作为优选，宿主菌为大肠杆菌。
[0026本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚麻苦苷酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为以下(a)～(d)的任意一项或任意两项或任意三项或四项的组合：(a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第263位的赖氨酸突变为脯氨酸；(b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第53位的苏氨酸突变为苯丙氨酸；(c)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第366位的丝氨酸突变为精氨酸；(d)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第335位的缬氨酸突变为半胱氨酸，第339位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸。2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括原始表达质粒以及插入在原始表达质粒多克隆位点中的编码如权利要求1所述的亚麻苦苷酶突变体的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆柏益，钟永恒，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：