一种改善反刍动物胴体品质的突变酶复合制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种改善反刍动物胴体品质的突变酶复合制剂及其应用。所述突变酶复合制剂是以植物甾醇、内切葡聚糖酶酶液和纤维素酶

【技术实现步骤摘要】
一种改善反刍动物胴体品质的突变酶复合制剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种改善反刍动物胴体品质的突变酶复合制剂及其应用。

技术介绍

[0002]植物固醇，是以游离状态或与脂肪酸和糖等结合的状态存在的一种功能性成分，广泛存在于蔬菜、水果等各种植物的细胞膜中，其对人体健康有很多益处，有防治前列腺肥大、抑制肿瘤、抑制乳腺增生和调节免疫等作用，还可以与胆固醇竞争，减少胆固醇吸收。
[0003]随着宏基因组筛选方法的广泛运用，目前已有多种内切葡聚糖酶从草食动物的瘤胃中获得，如驼鹿、绵羊、水牛、奶牛和骆驼。但是大部分候选纤维素酶没有被克隆和表征。内切葡聚糖酶通过底物结合口袋与底物锚定，进一步被活性催化位点催化。因此，挖掘瘤胃微生物宏基因组中内切葡聚糖酶可以为内切葡聚糖酶的开发提供新的研究思路，同时对底物结合口袋进行适当的定点突变，提高酶与底物结合稳定性。
[0004]另外，纤维素酶和木聚糖酶的混合使用已经广泛用于木材生物制浆、造纸、纺织、农业废物处理、生物燃料和果汁加工等工业应用。然而，这种组合在反刍动物中几乎没有被用作饲料添加剂。但是多酶复合使用会提高经济成本，为此，双功能酶的应用有望解决此问题。因此，挖掘双功能酶与一些天然成分的组合可以为该酶的更好提供新的思路，同时将纤维素酶
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木聚糖酶制剂用作饲料酶制剂，提高饲料转化率，有利于动物的生长。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种改善反刍动物胴体品质的突变酶复合制剂及其应用。所述突变酶复合制剂具有明显改善反刍动物胴体品质的作用，有利于动物的生长和养殖。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0007]本专利技术提供了一种突变酶复合制剂，所述突变酶复合制剂中含有植物甾醇、内切葡聚糖酶酶液和纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶酶液。
[0008]进一步的，所述植物甾醇、内切葡聚糖酶酶液和纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶酶液的体积比为3:1～3:2～4。
[0009]进一步的，所所述内切葡聚糖酶酶液是由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa制备得到的；所述纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶酶液是由氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶突变体CelXyn2
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S343制备得到的。
[0010]进一步的，所述内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa是由氨基酸序列为SEQ ID No.1的内切葡聚糖酶的第124位的缬氨酸突变为色氨酸以及第128位的丝氨酸突变为酪氨酸获得的。
[0011]进一步的，所述纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶突变体CelXyn2
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S343是由氨基酸序列为SEQ ID No.4的纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶的第343位的半胱氨酸突变成丝氨酸获得
的。
[0012]本专利技术还提供了所述的突变酶复合制剂在制备用于改善反刍动物胴体品质的饲料添加剂中的应用。
[0013]进一步的，所述内切葡聚糖酶突变体和纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶突变体的酶活均不低于500U/mL。
[0014]进一步的，所述突变酶复合制剂的添加量为100g/t～200g/t饲料。
[0015]进一步的，所述突变酶复合制剂能够明显提高反刍动物瘤胃中挥发性脂肪酸的产量，并降低肌内脂肪含量。
[0016]进一步的，所述反刍动物为牛和羊。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的优点和有益技术效果是：
[0018]1、本专利技术对内切葡聚糖酶以及纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶的底物结合口袋中的活性位点进行定点突变，将得到内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa以及纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶突变体CelXyn2
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S343在大肠杆菌中成功表达，并将其纯化得到的两种突变体酶液与植物甾醇复配，得到突变酶复合制剂。
[0019]2、所述突变酶复合制剂的制备工艺简单，经体内和体外实验证实，其具有明显的提高奶牛和湖羊瘤胃中挥发性脂肪酸产量的作用，且能提高湖羊瘤胃底物降解率、产气量，并降低肌内脂肪含量，进而明显改善反刍动物的胴体品质，促进其生长，有利于反刍动物的养殖发展。
具体实施方式
[0020]结合以下具体实例对本专利技术的技术方案作进一步详细的说明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
[0021]实施例1：内切葡聚糖酶突变体的获取和纯化
[0022]1、以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切葡聚糖酶的蛋白质结构域，预测并通过同源性比较找出决定内切葡聚糖酶的底物结合口袋位点，进行活性位点突变，突变位点为V124W和S128Y，得到内切葡聚糖酶突变体，命名为TrepCel3
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Aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0023]内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa只包含糖苷水解酶第5家族；该酶可以从内部水解纤维素的主链，且该突变体酶的最适温度和最适pH分别为40℃和5.0。
[0024]2、以内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa的基因和pET28a为表达载体，构建含有内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa的重组表达载体，然后转入大肠杆菌(DE3)，得到含有内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa的重组菌株。
[0025]将重组菌株活化培养后接入6mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm/min条件下过夜培养。随后6mL的菌液分别转移到装有600mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基的细颈瓶中，于37℃、200rpm/min条件下振荡培养。当细颈瓶中的液体培养基的OD 600值达到0.5～0.6时，每个瓶中加入IPTG(终浓度为0.5mM)，15℃、150rpm/min继续诱导培养24h。8000rpm/min、4℃离心20min，去掉上清用缓冲液重悬浮菌体细胞，然后破碎
细胞壁，于12000g、4℃离心30min，收集上清液。将上述获得的上清液使用AKTA Pure蛋白纯化仪通过镍柱对其进行His纯化后所得纯化溶液，即为纯化的内切葡聚糖酶突变体酶液。
[0026]实施例2：纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶突变体的获取和纯化
[0027]以氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变酶复合制剂，其特征在于，所述突变酶复合制剂中含有植物甾醇、内切葡聚糖酶酶液和纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶酶液。2.根据权利要求1所述的突变酶复合制剂，其特征在于，所述植物甾醇、内切葡聚糖酶酶液和纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶酶液的体积比为3:1～3:2～4。3.根据权利要求1所述的突变酶复合制剂，其特征在于，所述内切葡聚糖酶酶液是由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa制备得到的；所述纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶酶液是由氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的纤维素酶
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木聚糖酶双功能酶突变体CelXyn2
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S343制备得到的。4.根据权利要求3所述的突变酶复合制剂，其特征在于，所述内切葡聚糖酶突变体TrepCel3
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Aa是由氨基酸序列为SEQ ID No.1的内切葡聚糖酶的第12...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕东海，成艳芬，唐志刚，
申请(专利权)人：南京诺齐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：