一种提高甲壳类动物生长性能的酶复合制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高甲壳类动物生长性能的酶复合制剂及其应用。所述酶复合制剂是以植物甾醇和内切葡聚糖酶酶液3:1～3的体积比制备得到的，其中内切葡聚糖酶酶液是由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4

【技术实现步骤摘要】
一种提高甲壳类动物生长性能的酶复合制剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种提高甲壳类动物生长性能的酶复合制剂及其应用。

技术介绍

[0002]植物固醇，是以游离状态或与脂肪酸和糖等结合的状态存在的一种功能性成分，广泛存在于蔬菜、水果等各种植物的细胞膜中，其对人体健康有很多益处，有防治前列腺肥大、抑制肿瘤、抑制乳腺增生和调节免疫等作用，还可以与胆固醇竞争，减少胆固醇吸收。
[0003]随着宏基因组筛选方法的广泛运用，目前已有多种内切葡聚糖酶从草食动物的瘤胃中获得，如驼鹿、绵羊、水牛、奶牛和骆驼。但是大部分候选纤维素酶没有被克隆和表征。内切葡聚糖酶通过底物结合口袋与底物锚定，进一步被活性催化位点催化。因此，挖掘瘤胃微生物宏基因组中内切葡聚糖酶可以为内切葡聚糖酶的开发提供新的研究思路，同时对底物结合口袋进行适当的定点突变，提高酶与底物结合稳定性。
[0004]而现在酶制剂用于动物养殖的研究逐渐增加，因此，研究来源天然的酶以及天然组分的复合对促进养殖的生长具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种提高甲壳类动物生长性能的酶复合制剂及其应用。所述酶复合制剂能够明显提高螃蟹的抗氧化能力以及对虾的体重，有利于甲壳类动物的生长。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0007]本专利技术提供了一种酶复合制剂，所述酶复合制剂中含有植物甾醇和内切葡聚糖酶酶液。
[0008]进一步的，所述植物甾醇和内切葡聚糖酶酶液的体积比为3:1～3。
[0009]进一步的，所述内切葡聚糖酶酶液是由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa制备得到的。
[0010]进一步的，所述内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa是由氨基酸序列为SEQ ID No.1的内切葡聚糖酶的第201位的组氨酸突变为色氨酸以及第252位的谷氨酸突变为酪氨酸获得的。
[0011]进一步的，所述内切葡聚糖酶酶液的酶活不低于650U/mL。
[0012]本专利技术还提供了所述的酶复合制剂在用于制备提高甲壳类动物生长性能的饲料添加剂中的应用。
[0013]进一步的，所述甲壳类动物为螃蟹和对虾。
[0014]进一步的，当所述酶复合制剂用于螃蟹养殖时，用量为25g/t～100g/t饲料。
[0015]进一步的，当所述酶复合制剂用于对虾养殖时，添加量为对虾饲料质量的0.05％～0.8％。
[0016]进一步的，所述酶复合制剂能够提高螃蟹的抗氧化能力以及对虾的体重。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的优点和有益技术效果是：
[0018]1、本专利技术对内切葡聚糖酶的底物结合口袋中的活性位点进行定点突变，将得到内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa在大肠杆菌中成功表达，并将其纯化得到的突变体酶液与植物甾醇复配，得到酶复合制剂。
[0019]2、所述酶复合制剂的制备工艺简单，经实验证实，其具有明显的提高螃蟹的抗氧化能力以及对虾的体重，进而提高甲壳类动物的免疫力和生长能力，有助于甲壳类动物的养殖。
具体实施方式
[0020]结合以下具体实例对本专利技术的技术方案作进一步详细的说明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
[0021]实施例1：内切葡聚糖酶突变体的获取和纯化
[0022]1、以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切葡聚糖酶的蛋白质结构域，预测并通过同源性比较找出决定内切葡聚糖酶的底物结合口袋位点，进行活性位点突变，突变位点为H201W和E252Y，得到内切葡聚糖酶突变体，命名为TrepCel4
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Aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0023]内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa只包含糖苷水解酶第5家族；该酶可以从内部水解纤维素的主链，且该突变体酶的最适温度和最适pH分别为50℃和6.0。
[0024]2、以内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa的基因和pET28a为表达载体，构建含有内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa的重组表达载体，然后转入大肠杆菌(DE3)，得到含有内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa的重组菌株。
[0025]将重组菌株活化培养后接入6mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm/min条件下过夜培养。随后6mL的菌液分别转移到装有600mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基的细颈瓶中，于37℃、200rpm/min条件下振荡培养。当细颈瓶中的液体培养基的OD 600值达到0.5～0.6时，每个瓶中加入IPTG(终浓度为0.5mM)，15℃、150rpm/min继续诱导培养24h。8000rpm/min、4℃离心20min，去掉上清用缓冲液重悬浮菌体细胞，然后破碎细胞壁，于12000g、4℃离心30min，收集上清液。将上述获得的上清液使用AKTA Pure蛋白纯化仪通过镍柱对其进行His纯化后所得纯化溶液，即为纯化的内切葡聚糖酶突变体酶液。
[0026]实施例2：酶复合制剂对虾蟹生长性能的影响实验
[0027]1、将植物甾醇与实施例1的内切葡聚糖酶突变体酶液以3:2的体积比混合均匀，得到酶复合制剂，其中内切葡聚糖酶突变体酶液的酶活650U/mL。
[0028]2、对螃蟹生长性能的影响
[0029]选用健康、无病、行动活泼及外观完整的公蟹母蟹，试验前喂养7天，使其适应环境，选用大小均匀、健康完整、行动灵敏的个体进行试验，试验开始前一天停止喂食。取8个2L的烧杯洗净烘干，公蟹母蟹分开进行，每组设置一个空白对照与加入25g/t、50g/t、100g/t酶复合制剂的三个试验组进行对比，每个烧杯中随机放进6只螃蟹，试验组投喂加入不同浓度的酶复合制剂的饲料，空白组投喂饲料，试验连续进行5天。
[0030]在第5天，在试验组与空白对照组分别取出4只螃蟹，将螃蟹低温致死，按螃蟹肌肉：Tris
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HCl缓冲液为1:5(g/ml)进行匀浆，在冰浴状态下匀浆以保证酶活，匀浆液在6000r/min、4℃离心10min,取上清液，用缓冲液稀释20倍进行后续试验。螃蟹肌肉中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能酶(T
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AOC)酶活性测定试剂来自南京建成生物工程研究所，按试剂盒操作说明进行。
[0031]结果如表1所示，不同浓度的酶复合制剂能够显著提高公蟹本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶复合制剂，其特征在于，所述酶复合制剂中含有植物甾醇和内切葡聚糖酶酶液。2.根据权利要求1所述的酶复合制剂，其特征在于，所述植物甾醇和内切葡聚糖酶酶液的体积比为3:1～3。3.根据权利要求1所述的酶复合制剂，其特征在于，所述内切葡聚糖酶酶液是由氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa制备得到的。4.根据权利要求3所述的酶复合制剂，其特征在于，所述内切葡聚糖酶突变体TrepCel4
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Aa是由氨基酸序列为SEQ ID No.1的内切葡聚糖酶的第201位的组氨酸突变为色氨酸以及第252位的谷氨酸突变为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕东海，成艳芬，唐志刚，
申请(专利权)人：南京诺齐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：