一种水解东莨菪苷的重组β-葡萄糖苷酶的制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种水解东莨菪苷的重组β

【技术实现步骤摘要】
一种水解东莨菪苷的重组
β
‑
葡萄糖苷酶的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种水解东莨菪苷的重组β
‑
葡萄糖苷酶的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]东莨菪素(Scopoletin)又称东莨菪内酯、莨菪亭，属香豆素类化合物，化学名为6
‑
甲氧基
‑7‑
羟基香豆素；在自然界分布广泛，存在于丁公藤茎、拟南芥全株、天竺葵等植物中。东莨菪素不仅具有抗肿瘤、抗炎及镇痛、降血压血脂、保肝、增强记忆和解痉等药理活性；还具有杀虫、杀螨、抑菌等农用生物活性。
[0003]由于人工合成东莨菪素的成本高、制备条件难以控制，目前制备东莨菪素的方法主要是从植物中萃取。研究表明，自然界中东莨菪苷和东莨菪素大多共存于同一植物体中，且东莨菪苷的含量普遍大于东莨菪素的含量，多次分离纯化导致提取回收率低、成本高，且环境污染大。例如从药物丁公藤中提取东莨菪素过程中，其提取物中含有大量的其他物质，会影响东莨菪素的提取率。
[0004]相关技术中也有用酶法将东莨菪苷转化为东莨菪素，但由于目前转化东莨菪苷的酶具有广谱的底物特异性，在将植物组织中的东莨菪苷转化的同时，也会转化其他糖苷，产生了大量的东莨菪素结构类似物，同样导致分离困难。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即制备专一性转化东莨菪素的重组β
‑
葡萄糖苷酶，可用于酶法处理植物组织及其初提取物，专一性转化东莨菪苷为东莨菪素，从而增加东莨菪素的提取得率及纯度。
[0006]为此，在本专利技术的第一个方面中，本专利技术提出了一种水解东莨菪苷的重组β
‑
葡萄糖苷酶的制备方法，其包括以下步骤：
[0007](1)利用NCBI数据库从genebank中搜索，得到16条黑曲霉CBS513.88来源β
‑
葡萄糖苷酶序列，对其进化树分析，并以东莨菪苷为底物进行分子对接，筛选出核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3；
[0008](2)以PUC
‑
57
‑
An
‑
bgl3
‑
Amp质粒为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列为引物进行PCR扩增，再将扩增产物与pPIC9K质粒连接，转化至毕赤酵母SMD1168中，获得重组菌株，重组菌株诱导表达，即获得重组β
‑
葡萄糖苷酶。
[0009]根据本专利技术的实施例的水解东莨菪苷的重组β
‑
葡萄糖苷酶的制备方法，该方法通过对黑曲霉来源的β
‑
葡萄糖苷酶的基因组中的β
‑
葡萄糖苷酶进行系统进化分析，以东莨菪苷为底物进行分子对接，筛选对东莨菪苷具有良好的底物特异性的β
‑
葡萄糖苷酶，进一步通过毕赤酵母SMD1168异源表达以制备高效、专一将植物提取物中东莨菪苷水解转化为东莨菪素，提高东莨菪素的得率及纯度的重组β
‑
葡萄糖苷酶。
[0010]在本专利技术的第二方面中，提供了一种上述制备方法制得的重组β
‑
葡萄糖苷酶。该
2mL/min流速洗脱目的蛋白，收集相应洗脱成分放入4℃中。)进行纯化，通过SDS
‑
PAGE 检验，如图3所示，β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3为均一条带，大小约为120kDa。
[0031]从SDS
‑
PAGE切出相应的条带，并进行胰蛋白酶水解的产物进行MS分析。通过 LC
‑
MS/MS(ExactivenanoLC
‑
Q)(A液为0.1％甲酸的水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡后,样品由自动进样器上样至Trap柱。0.5H梯度)鉴定分离的重组β
‑
葡萄糖苷酶，如图4。再通过MASCOT等质谱匹配软件对LCMSMS数据进行分析获得目标蛋白质多肽分子的定性鉴定信息，该重组蛋白鉴定为 Beta
‑
glucosidase(Aspergillus niger)，UniProt数据库登录号为A0A117E2F4。
[0032]实施例2β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3的底物特异性
[0033]分别测定重组β
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葡萄糖苷酶An
‑
bgl3(实施例1获得的)与2mmol/L的不同的底物(对硝基苯基
‑
β
‑
D
‑
吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基
‑
α
‑
D
‑
吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基
‑
N
‑
乙酰基
‑
β
‑
D
‑ꢀ
吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷、栀子苷、水杨苷、虎杖苷、七叶苷和东莨菪苷)在55℃反应20min后的酶活力来研究该酶的底物特异性。测定结果显示如表1， An
‑
bgl3仅对香豆素类底物有转化作用且对东莨菪苷转化能力更强。
[0034]表1
[0035][0036]实施例3β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3最适温度及pH
[0037]酶活的测定：600μL的pH 4.0的2mmol/L的东莨菪苷溶液与100μL的重组β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3酶液在55℃条件下反应20min后，于沸水浴10min终止反应，冷却至室温经微孔过滤后反应液通过HPLC检测东莨菪苷的含量。
[0038]在pH 5.0条件下，参照酶活的测定方法通过测定重组β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3在40～75℃温度范围内(每隔5℃)的酶活力来探究该酶的最适温度。结果如图5所示，重组β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3的最适温度为55℃。
[0039]用50mmol/L的不同pH(pH 3.0～6.0)的柠檬酸缓冲液与(pH 6.0～8.0)磷酸盐缓冲液配制2mmol/L的东莨菪苷底物溶液。参照酶活的测定方法测定重组β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3与上述不同pH值的底物反应时的酶活力来探究该酶的最适pH。结果如图6所示，重组β
‑ꢀ
葡萄糖苷酶An
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bgl3的最适pH为4.0。
[0040]实施例4β
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水解东莨菪苷的重组β
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葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用NCBI数据库从genebank中搜索，得到16条黑曲霉CBS513.88来源β
‑
葡萄糖苷酶序列，对其进化树分析，并以东莨菪苷为底物进行分子对接，筛选出核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的β
‑
葡萄糖苷酶An
‑
bgl3；(2)以PUC
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57
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An
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bgl3
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Amp质粒为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：李利君，于坤朋，倪辉，彭程，林燕玲，杨远帆，姜泽东，李清彪，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：