一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用。本所述几丁质酶PbChia1来源于根肿菌，体外表达的PbChia1蛋白可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发，延缓根肿菌的发育，缓解油菜根肿病根肿的症状，生防效果为61.29％。超表达PbChia1的转基因植物可以显著降低根肿菌在植物内的定殖率，延缓根肿菌的发育，对根肿病的生防效果高达62.3％。转基因植株对活体营养型病原丁香假单胞菌PstDC3000及死体营养型病原核盘菌和立枯丝核菌均显示抗病能力。表明根肿菌几丁质酶PbChia1可为根肿病的绿色防控提供新基因资源。源。源。

【技术实现步骤摘要】
一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用。

技术介绍

[0002]十字花科根肿病是世界范围的重要植物病害，该病害由原生动物根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起，主要危害植物根部。根肿菌不仅侵染油菜，而且还侵染十字花科蔬菜，如白菜、花菜、萝卜、包菜、西兰花等。根肿病是典型的土传病害，防治困难，一旦有根肿病危害的地块基本很难清除，因此迫切需要高效的根肿病绿色防控技术。
[0003]几丁质是n
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乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖，主要存在于昆虫和甲壳类动物的外骨骼，真菌和硅藻的细胞壁中，有的原生动物中也含有几丁质。而植物和高等动物中不含有几丁质，几丁质代谢过程中的合成酶和水解酶都可以设计为绿色药剂的理想分子靶标，但是目前对于根肿菌中几丁质酶的代谢途径研究并不深入，需要开发新的功能基因。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用，无论是自体来源的几丁质酶还是外源的几丁质酶都使得植物对于根肿菌的抗性增强，为根肿病的绿色防控提供新基因资源。
[0005]本专利技术提供了一种抗根肿菌的几丁质酶，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术还提供了一种编码上述几丁质酶的基因。
[0007]优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了一种体外表达上述几丁质酶的原核表达载体。
[0009]优选的，所述原核表达载体的基础载体包括pGEX
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6p
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1和/或pET
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28a。
[0010]本专利技术还提供了上述几丁质酶在提高作物根肿病抗性中的应用。
[0011]优选的，所述几丁质酶的来源包括自体表达和/或体外表达。
[0012]优选的，所述根肿病抗性包括抑制休眠根肿菌孢子萌发、延缓根肿菌的发育和/或缓解根肿病根肿症状。
[0013]本专利技术还提供了一种通过创制超表达上述基因的转基因株系在获取抗根肿病材料中的应用。
[0014]优选的，抗根肿病材料的性状包括：显著降低根肿菌在植物内的定殖率和/或延缓根肿菌的发育。
[0015]有益效果：本专利技术利用几丁质pull
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down和LC
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MS分析筛选和鉴定出一种来源于根肿菌的几丁质酶PbChia1，体外表达的PbChia1蛋白可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发，延缓根肿菌的发育，缓解油菜根肿病根肿的症状，生防效果为61.29％。超表达PbChia1的转基因
植物可以显著降低根肿菌在植物内的定殖率，延缓根肿菌的发育，对根肿病的生防效果高达62.3％。转基因植株对活体营养型病原丁香假单胞菌Pst DC3000及死体营养型病原核盘菌和立枯丝核菌均显示抗病能力。本专利技术证实表明超表达PbChia1的转基因植物使植物获得了较广的抗病能力，说明几丁质酶PbChia1具有很好的应用前景。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1为PbChia1基因结构、表达分析及信号肽的功能验证，其中A：根肿菌ZJ
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1菌株PbChia1基因结构图；B：根肿菌ZJ
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1菌株PbChia1基因表达模式；C：利用酵母系统验证根肿菌ZJ
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1菌株PbChia1蛋白信号肽功能；
[0018]图2为PbChia1蛋白体外几丁质酶活性，其中A和C为PbChia1蛋白几丁质酶活的检测；B和D为PbChia1蛋白结合几丁质的能力检测；
[0019]图3为PbChia1蛋白体外抑制根肿菌的休眠孢子的萌发，其中A：PbChia1几丁质酶处理3d后，根肿菌休眠孢子的浓度，PB为阴性对照，PB+PbChia1为处理组，用PbChia1处理根肿病的休眠孢子；B：PbChia1几丁质酶处理3d后，根肿病休眠孢子萌发率的统计；one
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wayANOVA，p<0.05，n＝3；C：根肿病休眠孢子DAPI染色，标尺大小为10μm；
[0020]图4为PbChia1在体外防治油菜根肿病，其中A为用几丁质酶处理水培油菜的根部表型，植株照片拍摄于处理后30d，标尺大小为1cm；B为根肿菌接种30dpi 24
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28株油菜的不同发病等级的百分率和病情指数统计，t
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test，p<0.05；C为qPCR检测病根中根肿菌的含量，内参基因为油菜的Actin基因，以根肿菌Actin基因指示根肿菌含量，n＝3，one
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wayANOVA检验分析差异性，p<0.05，试验重复3次，结果相似；
[0021]图5为PbChia1处理油菜根肿病的含菌比例，其中A：石蜡切片观察接种根肿菌30d的油菜病根，红色五角星标记根肿菌，标尺＝1um；B：根细胞内含菌的比例；
[0022]图6为超表达PbChia1转基因拟南芥的生长表型，其中A：超表达PbChia1转基因拟南芥生长表型；B：Westernblot鉴定阳性转基因植株；C：超表达PbChia1转基因拟南芥3d根毛数量的统计，n＝6；D：超表达PbChia1转基因拟南芥10d根毛数量的统计，n＝11；E：PbChia1转基因拟南芥10d根长的统计，n＝6；F：超表达PbChia1转基因拟南芥200粒种子重量的测定，n＝6；one
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wayANOVA，p<0.05；
[0023]图7为超表达PbChia1拟南芥显示抗根肿的表型，其中A：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌21d后的根部表型，标尺大小为1cm；B：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌21d后的病情指数统计，n＝40；C：qPCR检测超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌21d后根肿菌的含量，n＝3；one
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wayANOVA检验差异性，p<0.05；
[0024]图8为超表达PbChia1可以提高植株的存活率和产量，其中A：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌后的表型，标尺大小为1cm；B：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌30d和55d后的存活率统计；C：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌后收获种子并进行称量统计；one
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wayANOVA检验分析差异性，p<0.05，n＝3；
[0025]图9为超表达PbChia1转基因植株与野生型植株植物根部的根毛和皮层感染的比较(标尺＝10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗根肿菌的几丁质酶，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述几丁质酶的基因。3.根据权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种体外表达权利要求1所述几丁质酶的原核表达载体。5.根据权利要求4所述原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体的基础载体包括pGEX
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6p
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1和/或pET
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28a...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈桃，赵艳丽，谢甲涛，姜道宏，付艳苹，程家森，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：